Avaliação da Atividade Antitumoral de Frações de Extrato da Acácia Negra (Acacia mearnsii) em Célula de Câncer de Bexiga Humana T24

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Mendonça Diz, F. (PUCRS) ; dos Santos Grasel, F. (TANAC S/A) ; Cappellari, A.R. (PUCRS) ; Nunes de Menezes, M. (PUCRS) ; Rosa Zotti, E. (PUCRS) ; Ligabue, R.A. (PUCRS) ; Bueno Morrone, F. (PUCRS)

Resumo

O câncer de bexiga é o tipo de neoplasia mais comum do trato urinário. Em resultados anteriores foi verificado que o extrato bruto de acácia negra (PAC) interfere no processo de proliferação celular em células de câncer de bexiga. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antitumoral de seis frações de PAC (F1 a F6) em células de câncer de bexiga humana T24. Foi observado que F3, F5 e F6 não promoveram qualquer alteração celular nas concentrações testadas. F2 reduziu a viabilidade celular nas concentrações de 100 e 200 μg/mL, enquanto F4 aumentou a proliferação celular de 25 a 100 μg/mL. Já F1 apresentou um efeito dual: aumentou a proliferação celular nas concentrações de 3,125 a 12,5 μg/mL e reduziu a viabilidade celular em 50, 100 e 200 μg/mL após 24h.

Palavras chaves

Câncer de bexiga; PAC; Acácia negra

Introdução

No Brasil, o Rio Grande do Sul é responsável por 100% da produção nacional e aproximadamente 50% da produção mundial de extrato de Acacia mearnsii (PAC). Este extrato é composto basicamente por proantocianidinas, além de uma pequena fração de polissacarídeos e açúcares, os quais são extraídos em solução aquosa, sendo comercializados principalmente em pó para o curtimento de peles (REID et al. 2013). Um número crescente de estudos têm demostrado a atividade anticancerígena das PACs em diferentes tipos de câncer (STAGOS et al. 2012; WEH et al. 2016). Os estudos indicam que as proantocianidinas parecem ter um efeito de quimioprevenção para reverter, suprir ou prevenir a carcinogênese de alguns tipos de câncer. O câncer de bexiga é responsável por mais de 90% das malignidades no trato urinário. No Brasil, espera-se 9.670 novos casos de câncer de bexiga em 2017. Sendo a Região Sul uma das áreas mais acometidas. Para o ano de 2017, a estimativa do número de casos novos de câncer bexiga no Estado do Rio Grande do Sul é de 850 sendo 160 novos casos na capital Porto Alegre. A forma mais comum do câncer de bexiga acomete inicialmente o epitélio da bexiga, caracterizando o carcinoma de células transicionais (WANG et al. 2016). Outros tipos incluem o carcinoma de células escamosas ou adenocarcinoma, que se desenvolvem no revestimento interno da bexiga (FUNT et al. 2016). Adicionalmente, o câncer de bexiga está associado à expressão de diversos oncogenes comuns e tem como principais formas de tratamento a ressecção cirúrgica que pode ser seguida de quimio ou radioterapia. Diante do exposto acima, este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antitumoral de seis frações purificadas da acácia negra (F1, F2, F3, F4, F5 e F6) em células de câncer de bexiga humana T24.

Material e métodos

Tanto o PAC, quanto suas frações purificadas, foram cedidos pela empresa parceira, a TANAC S.A. Os estudos de avaliação biológicas in vitro do PAC bruto e das seis frações foram realizados no Laboratório de Farmacologia Aplicada (LAFAP) da Faculdade de Farmácia da PUCRS. Cultura e Manutenção das Células A linhagem celular humana de câncer de bexiga T24 foi cultivada em meio RPMI e suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantida em temperatura de 37°C, com umidade relativa do ar de 95% e atmosfera de 5% CO2. Para a realização dos experimentos as células foram tripsinizadas e plaqueadas conforme a necessidade. As culturas foram expostas aos tratamentos com PAC (6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 e 400 μg/mL) e com as frações de extrato da acácia negra (3,125; 6,2; 12,5; 25; 50; 100 e 200 μg/mL). Viabilidade Celular (MTT) A viabilidade celular foi determinada pela técnica de óxido-redução e formação de cristais de Formazan. As células foram plaqueadas em poços de 96 poços e após a confluência foram tratadas com as diferentes concentrações do PAC e das 6 frações purificadas. Após 24h de tratamento as células foram lavadas com PBS e na sequência, foi adicionado uma solução de MTT 0,5%. Após 3 horas de incubação, o meio foi removido e a placa foi mantida em temperatura ambiente por 24h, para secagem. Os cristais de formazan foram eluídos em DMSO e a intensidade de coloração foi determinada por espectrofotômetro a 570nm. Os resultados foram determinados em percentual da absorbância dos tratados em relação ao controle.

Resultado e discussão

Os resultados da viabilidade celular por MTT das frações purificadas de acácia negra estão exibidos na Figura 1. Os experimentos foram realizados pelo menos três vezes em triplicata. Cada coluna representa a média ± DP. Os dados foram analisados por One-way ANOVA, seguido por Tukey post-hoc. *** p <0.001, ** p <0.01, * p <0.05. Foi possível observar que a fração F2 apresentou redução da viabilidade celular nas concentrações de 100 e 200 μg/mL. Por outro lado, a fração F4 promoveu proliferação celular nas concentrações de 50 e 100 μg/mL. Já a fração F1 promoveu um efeito dual: apresentando proliferação celular nas concentrações de 3,125, 6,25 e 12,5 μg/mL e redução da viabilidade celular nas concentrações de 50, 100 e 200 μg/mL após 24 horas. As frações F3, F5 e F6 não promoveram nenhum efeito sobre a viabilidade celular nas concentrações testadas, após 24 horas. O perfil geral dos efeitos obtidos após a exposição às frações testadas difere dos resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo após a exposição ao tratamento realizado com o PAC. Apenas as frações F1 e F2 apresentaram redução da viabilidade celular nas mesmas concentrações efetivas do PAC (a partir de 100μg/mL) em células de câncer de bexiga humana T24. Considerando o objetivo proposto, torna-se evidente que esta investigação mostrou propriedades biológicas promissoras para as frações de extrato de acácia negra. Corroborando com resultados obtidos por WEH et al. (2016) e Kresty et al. (2015), ambos trabalharam com linhagens de câncer de esôfago (OE33, OE19 e JHAD1) e submeteram as células a tratamento exposto ao PAC de canbrerry e frações purificadas do extrato de canbrerry. Os autores relataram que tanto o PAC, quanto as frações testadas interferem no processo de proliferação celular.

Efeito do tratamento PAC e das frações (F1 a F6) na viabilidade celular do câncer de bexiga por meio do ensaio MTT.

Conclusões

Os resultados apresentados sugerem que tanto o PAC quanto as frações F1, F2 e F4 interferem na viabilidade celular da linhagem de câncer de bexiga humano T24. Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos de ação, contudo o extrato bruto e suas frações podem constituir uma potente ferramenta futura no tratamento do câncer de bexiga.

Agradecimentos

PUCRS, CNPq, CAPES, Finep, LAFAP, LOR, LACOG, TANAC S.A.

Referências

FUNT, S. A.; ROSENBERG, J. E. Systemic, perioperative management of muscle-invasive bladder cancer and future horizons. Nature Reviews Clinical Oncology, 14, 221, 2016.
KRESTY, L. A., WEH, K. M., ZEYZUS-JOHNS, B., PEREZ, L. N., HOWELL, A. B. Cranberry proanthocyanidins inhibit esophageal adenocarcinoma in vitro and in vivo through pleiotropic cell death induction and PI3K/AKT/mTOR inactivation. Oncotarget, 6, 33438, 2015.
REID, D. G.; BONNET, S. L.; KEMP, G.; WESTHUIZEN, J. H. Analysis of commercial proanthocyanidins. Part 4: Solid state 13C NMR as a tool for in situ analysis of proanthocyanidins tannins, in heartwood and bark of quebracho and acacia, and related species. Phytochemistry 94, 243, 2013.
STAGOS, D.; AMOUTZIAS, G.D.; MATAKOS, A.; SPYROU, A.; TSATSAKIS, A.M.; KOURETAS, D. Chemoprevention of liver cancer by plant polyphenols. Food and Chemical Toxicology 50, 2155, 2012.
WANG, G.; CAO, R.; WANG, Y.; QIAN, G.; DAN, H. C.; JIANG, W. Simvastatin induces cell cycle arrest and inhibits proliferation of bladder cancer cells via PPARγ signaling pathway. Scientific Reports, 6, 1, 2016.
WEH, K. M., AIYER, H. S., HOWELL, A. B., KRESTY, L. A. Cranberry proanthocyanidins modulate reactive oxygen species in Barrett’s and esophageal adenocarcinoma cell lines. Journal of berry research, 6, 125, 2016.