PLATAFORMA DIAGNÓSTICA BASEADA EM NANOCOMPÓSITOS PARA DETECÇÃO MULTIPLEX DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ESPECÍFICOS DO VÍRUS ZIKA

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Rios Moço, A.C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU) ; Honorato de Castro, A.C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU) ; Sousa da Silva, H. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU) ; Vieira da Silva, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU) ; Rodrigueiro Flauzino, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU) ; Brito-madurro, A.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA - UFU)

Resumo

Este trabalho visa o desenvolvimento de plataformas diagnósticas para a eletrodetecção do vírus Zika. Eletrodos de grafite foram modificados com nanocompósito (poli-tiramina/óxido de grafeno reduzido) e sensibilizados com três sequências de DNA específicas para o vírus Zika. A hibridização com as sequências complementares foi monitorada diretamente usando a adenosina como biomarcador e indiretamente usando brometo de etídio como intercalador. Foi observada uma diferença nos valores de corrente de pico para os biossensores na ausência e presença do alvo, usando detecção direta e indireta de 1,6 vezes e 1,4 vezes, respectivamente. Estes resultados confirmam o reconhecimento das sondas específicas para o vírus Zika pelos seus alvos complementares.

Palavras chaves

diagnóstico; Zika; poli(tiramina)/OG-r

Introdução

A infecção por vírus Zika (ZIKV) tornou-se questão emergencial em termos de saúde global desde a epidemia no Brasil em 2015. Desde então o vírus tem se espalhado para outros países na América Latina e nos Estados Unidos (POSSAS, 2016). Em mais de 80% dos casos a infecção parece ser assintomática (SHAH; KUMAR, 2016) porém, no restante dos casos, a manifestação clínica sintomática inclui desde febre até distúrbios gastrointestinais (SHARMA; LAL, 2017). Todavia, a preocupação mundial reside no fato do grande aumento de casos relatados de microcefalia pré-natal após o surto pandêmico (MLAKAR et al., 2016). O controle e monitoramento da infecção por ZIKV são limitados devido a indisponibilidade de drogas, vacinas e diagnóstico rápido. Neste último fator, o teste diagnóstico mais utilizado é a técnica de transcriptase reversa (RT-PCR) que consiste em um método laboroso e de difícil maquinário de execução (SHARMA; LAL, 2017). Neste contexto, os biosensores eletroquímicos mostram-se soluções eficientes e de baixo custo no controle da infecção (KAUSHIK et al., 2017). O presente trabalho obteve êxito no objetivo de imobilizar e detectar direta e indiretamente, com o mediador brometo de etídio, três sequências sintéticas de oligonucleotídeos específicos para o ZIKV em eletrodos modificados com óxido de grafeno reduzido (OG-r) e poli(tiramina).

Material e métodos

A redução eletroquimica do OG, eletropolimerização da tiramina e demais medidas voltamétricas foram realizadas em células de três compartimentos conectadas ao potenciostato (CH Instruments 420A). A platina foi utilizada como contra-eletrodo e prata-cloreto de prata como referência (Ag/AgCl). Como eletrodo de trabalho um disco de grafite com 6 mm de diâmetro foi obtido a partir de um bastão de grafite com 99.9995 % de pureza. O preparo destes eletrodos foi conseguido segundo Castro et al. (2014). A redução de OG e eletropolimerização da tiramina foram realizadas por voltametria cíclica. O OG sintetizado de acordo com Silva et al. (2017) foi reduzido eletroquimicamente em tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4. Posteriormente, sobre o eletrodo de grafite com OG-r, a solução de tiramina a 2,5 µmol/L foi eletropolimerizada formando filmes de poli(tiramina).Todas as soluções foram previamente desoxigenados em nitrogênio ultra puro por 25 minutos e os eletrodos lavados com água deionizada após os ensaios. As sequências de oligonucleotídeos específicas para ZIKV utilizadas neste trabalho foram sintetizadas pela Macrogen (Coréia do Norte). A imobilização das três sequências (ZIKV-MixS) foi realizada nos eletrodos modificados com politiramina/OG-r gotejando 1 µmol/L. Após 1 hora em T.A os eletrodos foram lavados em tampão fosfato. Seguidamente, foram gotejadas as sequências-alvo de ZIKV (ZIKV-MixA) a 1 µmol/L e colocados a 10 minutos a 42° C. Após o tempo de hibridização das sequências os eletrodos foram novamente lavados em tampão fosfato e submetidos a detecção direta por voltametria de pulso diferencial monitorando o pico de oxidação da adenosina.Na detecção indireta, o brometo de etídio a 100 µmol/L foi adicionado nos eletrodos por 10 minutos a T.A. Todos os experimentos foram realizados com n=3.

Resultado e discussão

As Figuras 1 e 2 mostram a eficiência das detecções direta e indireta, respectivamente, por voltametria de pulso diferencial. No primeiro caso houve o monitoramento do pico de oxidação da adenosina (Figura 1) em, aproximadamente, +1,23V vs Ag/AgCl e, no segundo caso, o monitoramento de BE em + 0,65V vs Ag/AgCl (Figura 2). Após o evento de hibridização, na Figura 1 (curva b), o indicativo de êxito da interação sonda e alvo é demonstrado pela diminuição da amplitude de corrente de pico de 1,6 vezes, quando comparado a sonda na ausência do alvo (curva a). Este decréscimo ocorre porque a dupla fita do DNA formada dificulta a oxidação dos resíduos de bases do DNA (OLIVEIRA-BRETT et al., 2004). Por outro lado, na Figura 2 (curva b) observa-se aumento da corrente de pico de oxidação do BE de 1,4 vezes, após hibridização das sondas e alvos. O pico aumenta em resposta do acúmulo de BE sobre a superfície do eletrodo, permitindo que este intercale no duplex de DNA e ocorre acréscimo na resposta de corrente (CASTRO et al., 2014).

Eletrodos de grafite modificados com OG- r/Poli(tiramina)/ZIKV-MixS antes (a) e após a hibridização com ZIKV-MixA (b).


Brometo de etídio em eletrodos de grafite modificados com OG-r/Poli(tiramina)/ZIKV-MixS antes (a) e após a hibridização com ZIKV-MixA (b).

Conclusões

Por meio de dois métodos de detecção, direto e indireto, foi possível detectar o evento de hibridização entre três sondas específicas do vírus Zika e seu DNAs alvos complementares. O eletrodo modificado com OG-r/Poli(tiramina) demonstrou eficiência na imobilização de sondas múltiplas de DNA sendo promissor como plataforma diagnóstica para infecção por Zika vírus em amostras reais.

Agradecimentos

CAPES, CNPq, FAPEMIG, UFU e LAFIP/BIOSENS.

Referências

CASTRO, A. C. H. et al. Preparation of genosensor for detection of specific DNA sequence of the hepatitis B virus. Applied Surface Science, v. 314, p.273-279, 2014.
KAUSHIK, A. et al. Electrochemical Biosensors for Early Stage Zika Diagnostics. Trends In Biotechnology, v. 35, n. 4, p.308-317, 2017.
MLAKAR, J. et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New England Journal Of Medicine, v. 374, n. 10, p.951-958, 2016.
OLIVEIRA-BRETT, A. M. et al. Voltammetric determination of all DNA nucleotides. Analytical Biochemistry, v. 332, n. 2, p.321-329, 2004.
POSSAS, C. Zika: what we do and do not know based on the experiences of Brazil. Epidemiology and Health, v. 38, p.1-7, 2016.
SILVA, J. V. et al. Modified electrode with reduced graphene oxide/poly(3-hydroxyphenylacetic acid): a new platform for oligonucleotide hybridization. Journal Of Solid State Electrochemistry, v. 21, n. 7, p.2129-2139, 18 abr. 2017.
SHAH, A.; KUMAR, A. Zika Virus Infection and Development of a Murine Model. Neurotoxicity Research, v. 30, n. 2, p.131-134, 2016.
SHARMA, A.; LAL, S. K. Zika Virus: Transmission, Detection, Control, and Prevention. Frontiers in Microbiology, v. 8, p.1-14, 2017.