Detecção eletroquímica indireta de um oligonucleotídeo específico para Staphylococcus aureus

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Peres, R.C.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Flauzino, J.M.R. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, A.G.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA)

Resumo

Neste trabalho, foi desenvolvido um bioeletrodo para a detecção de um oligonucleotídeo específico para Staphylococcus aureus, visando a construção de dispositivos de detecção que possam ser aplicados à indústria alimentícia e na área hospitalar. Para isso, eletrodos de grafite foram sensibilizados com um oligonucleotídeo específico (STAP1) para S. aureus e utilizados para análises com o alvo complementar (STAP2) usando Hoechst 33258 como indicador por pela técnica de voltametria de pulso diferencial. Foi observado uma diferença de corrente de pico com a presença do alvo de cerca de 1,2 vezes confirmando o reconhecimento do bioeletrodo pelo seu analito. Dessa forma, o bioeletrodo apresenta-se promissor para a detecção de S. aureus.

Palavras chaves

bioeletrodo; genossensor; Staphylococcus aureus

Introdução

As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) são importantes na morbidade e mortalidade da população, além de considerável gasto com hospitalizações. Entre o ano de 2007 a 2016 foram registrados no Brasil 6.632 surtos de DTAs, 469.482 pessoas expostas, 118.104 doentes, 17.186 pessoas hospitalizadas (14,5%) e 109 óbitos registrados (0,09%) (BRASIL, 2016). O Staphylococcus aureus foi o segundo patógeno mais frequente em surtos com agente etiológico conhecido (BRASIL, 2013). É um patógeno de fácil propagação e contaminação, pois 40% da população adulta é portadora nasal de S. aureus, podendo ser maior dentro de hospitais (CAVALCANTI, 2005). O S. aureus ainda produz biofilmes resistentes a sanitizantes, enterotoxinas resistentes a altas temperaturas como processos de pasteurização, tem capacidade de adquirir resistência a antibióticos, sendo assim uma das bactérias mais virulentas (ZELENY et. al., 2015). A detecção das falhas na produção de alimentos é crucial para impedir a ocorrência de surtos de DTAs. Entretanto, as visitas de inspeção sanitária são ineficazes, não ocorrem com frequência e/ou profundidade adequadas que garanta um grau satisfatório de segurança sanitária dos alimentos produzidos. As análises microbiológicas são limitadas, estatisticamente, demoradas, de forma que, os resultados são obtidos, geralmente após os alimentos pesquisados serem consumidos (BRYAN, 1992). Os biossensores apresentam-se como alternativas às tecnologias analíticas tradicionais, por apresentarem vantagens como a especificidade, rapidez, portabilidade, baixo custo, simplicidade, precisão e sensibilidade (WANG, 2006). Dessa forma, esse trabalho visa a detecção eletroquímica indireta de um oligonucleotídeo específico para S. aureus.

Material e métodos

Para as medidas eletroquímicas, foi utilizado uma célula de três compartimentos e eletrodo de carbono grafite como trabalho (99,9999%, 6 mm de diâmentro), eletrodo de Ag/AgCl como referência e eletrodo de platina (2 cm2) como auxiliar acoplados a um potenciostato da marca CH Instruments, modelo 760C. Um oligonucleotídeo específico para S. aureus foi utilizado como sonda (STAP1) e sua fita complementar como alvo (STAP2) Sobre os eletrodos de trabalho foram gotejados 15 μL da solução de sonda STAP1 (63 µmol L-1), mantidos em estufa a 37 ºC por 20 min para promover a adsorção do oligonucleotídeo sobre superfície do grafite. O eletrodo passou por uma lavagem por imersão em tampão fosfato de sódio (0,1 mol L-1, pH 7,4), com o intuito de remover as sondas que não foram completamente adsorvidas. Esse processo de lavagem foi o mesmo para as etapas subsequentes. Para o bloqueio, foram gotejados 60 µL de solução de albumina de soro bovino (BSA, 0,5% em tampão fosfato de sódio) sobre os eletrodos, e os mesmos foram incubados a 37 ºC por 30 min. Após o bloqueio, o eletrodo foi novamente lavado para a retirada da BSA em excesso, seco e foram gotejados 15 µL da solução do oligonucleotídeo alvo STAP2 (189 µmol L-1). Os eletrodos foram incubados em estufa a 70 ºC por 15 min para a hibridização das fitas complementares de oligonucleotídeos. Após esse tempo, a superfície dos eletrodos foi lavada e seca. Foram adicionados 15 µL de solução aquosa de Hoechst 33258 (2x10-5 mol L-1) ao eletrodo e o mesmo foi incubado em temperatura ambiente por 15 min, seguido de lavagem. O pico de oxidação do Hoechst 33258 foi monitorado por meio da técnica de voltametria de pulso diferencial (+0,35 a +0,65 V vs. Ag/AgCl, v = 20 mV s-1, amplitude 50 mV, solução tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1, pH 7,4).

Resultado e discussão

Assim com em estudos anteriores (ZHAO et al., 2012; SAFAVIEH et al., 2012), foi utilizado o Hoechst 33258 para a detecção da hibridização do DNA analisado. Neste trabalho, foi observada uma diferença de corrente de pico com a presença do alvo de aproximadamente 1,2 vezes comparado ao bioeletrodo na ausência do alvo (Figura 1). Isso se deve ao fato do Hoechst 33258 possuir afinidade pela dupla fita de DNA, acumulando-se sobre a superfície do eletrodo na presença do duplex (STAP1:STAP2). Com relação a carga (Figura 2) houve um aumento de 1,3 vezes com a adição do alvo específico (STAP2), evidenciando o reconhecimento do bioeletrodo pelo seu analito. No estudo de Zhao et al. (2012), utilizou-se o intercalador Hoechst 33258 para a detecção da hibridização do DNA eletroquimicamente em 0,5V. O mesmo princípio eletroquímico foi utilizado no presente estudo para a detecção do DNA do Staphylococcus aureus. Ambos os estudos supracitados utilizaram-se de microchips, material mais caro e dispendioso para a sua produção e comercialização em larga escala comparados aos eletrodos de grafite artesanais utilizados neste estudo.

Voltamogramas de pulso diferencial da oxidação do Hoechst 33258 para o eletrodo de grafite na ausência (azul) e na presença (vermelho) do alvo.


Histogramas mostrando a carga envolvida no processo de oxidação do Hoechst 33258, referente aos voltamogramas da Figura 1.

Conclusões

O bioletrodo foi capaz de reconhecer o alvo específico (STAP2) utilizando detecção indireta e apresentou-se promissor para o desenvolvimento de um genossensor para a detecção de S. aureus, visando dispositivos rápidos aplicados na indústria alimentícia e na saúde pública.

Agradecimentos

Os autores agradecem a FAPEMIG, CAPES, CNPQ e a Rede Mineira de Química pelo apoio financeiro.

Referências

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica, Coordenação Geral de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN net). Brasília, 2014. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/sistema_informacao_agravos_notificacao_sinan.pdf>. Acesso em: 01.Nov.2016.

BRYAN, F.L. Hazard analysis critical control point evaluations: a guide to identifying hazards and assessing risks associated with food preparation na storage. Genebra, Word Health Organization, 1992.

CAVALCANTI, S. M. M. et. al. Prevalence of Staphylococcus aureus introduced into intensive care units of a university hospital. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 9, n. 1, p. 5663, 2005.

SAFAVIEH, M. et al. Microfluidic electrochemical assay for rapid detection and uantification of Echericha coli. Biosensors &bioelectronics, v. 31, p. 523-528, 2012.

WANG, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosensors &bioelectronics, v. 21, n. 10, p. 1887–92, 2006.

ZELENY, R. et al. Development of a reference material for Staphylococcus aureus enterotoxin A in cheese: Feasibility study, processing, homogeneity and stability assessment. Food Chemistry v. 168, p. 241–246, 2015.

ZHAO, H et al. Electrochemical DNA detection using Hoechst dyes in microfluidic chips. Current Applied Physics, v. 12, p. 1493-1496, 2012.