Otimização da produção de carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa em meio agroindustrial com melaço e água de maceração de milho
ISBN 978-85-85905-21-7
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Rodrigues, T. (FURG) ; D´amore, T. (FURG) ; Burkert, J. (FURG)
Resumo
A composição do meio de cultivo é um dos fatores importantes para a bioprodução de carotenoides microbianos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi a otimização do meio para produção de carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa aproveitando coprodutos agroindustriais como substratos alternativos. Os cultivos foram realizados em frascos agitados com 225 mL de meio, 10% de inóculo, incubados a 25°C, 150 rpm por 168 h e a composição do meio (melaço e água de maceração de milho) segundo o delineamento experimental 2². A maximização da produção de carotenoides obteve que a concentração de melaço deve ser 50 g/L e a água de maceração de milho de 3,5 g/L, e nestas condições é possível alcançar aproximadamente 1000 µg/L de carotenoides volumétricos e 8 g/L de biomassa.
Palavras chaves
Biocorante; Coproduto agroindustrial; Levedura
Introdução
Dentre os pigmentos naturais os carotenoides constituem um grupo com ampla distribuição na natureza responsáveis pela coloração (amarelo ao vermelho) de frutas, hortaliças, flores, algas, bactérias e fungos (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Possuem efeitos benéficos a saúde como a capacidade antioxidante (WANG et al., 2006), atividade pró-vitamina A e ação na redução do risco de desenvolvimento de doenças degenerativas (KIM; AHN; LEE-KIM, 2001) e cardiovasculares (RICCIONE, et al., 2009). O crescimento do mercado por alimentos mais saudáveis e benéficos a saúde, além da preocupação com a utilização de aditivos químicos nos alimentos fez com que houvesse um crescimento na produção de carotenoides obtidos naturalmente (SENSIENT, 2011). Apesar de vários micro-organismos possuírem a capacidade de biossíntese de carotenoides nem todos são industrialmente interessantes. No entanto, as leveduras se destacam pela necessidade básica de uma fonte de carbono e de nitrogênio para a biossíntese, o que é relativamente simples quando comparada a outros micro-organismos (VALDUGA et al, 2009). O gênero Rhodotorula têm sido estudado empregando-se substratos de baixo custo como fonte de nutrientes (BRANCO, 2010; SCHNEIDER et al. 2013; CHENG; YANG, 2016). Para a indústria oferece vantagens sobre os outros gêneros em termos da taxa de crescimento (MALISORN; SUNTORNSUK, 2008). O desenvolvimento de processos biotecnológicos para a produção de carotenoides visa o aumento do rendimento. No entanto um fator limitante é o custo relativamente alto destes processos. O emprego de substratos de baixo valor agregado, como os coprodutos agroindustriais se torna uma alternativa para que se minimize o custo desta produção (DAS et al., 2007). Dentre estes coprodutos o melaço de cana de açúcar tem sido utilizado como substrato para processos fermentativos. Resultante da cristalização final do açúcar, é composto por: água, açúcares em média 62%, compostos de origem orgânica e uma fração mineral composta principalmente por cálcio, magnésio, sódio e potássio (RAMBLA et al., 1999). Outro coproduto agroindustrial é a água de maceração de milho, obtida do processamento do milho, resultante da água de lavagem dos grãos (DE SOUZA, 2007). Esse coproduto é rico em carboidratos, aminoácidos, peptídeos, minerais, metais, vitaminas e fosfato. Assim, é um meio favorável aos processos fermentativos. Devido a sua composição esses coprodutos tem sido estudados como fonte de nutrientes para micro-organismos (RIVAS et al., 2004). Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi definir as concentrações dos componentes do meio de cultivo agroindustrial (água de maceração de milho e melaço) para a maximização da produção de carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa, através da técnica de planejamento experimental.
Material e métodos
A levedura Rhodotorula mucilaginosa isolada e identificada por Otero (2011) e depositada na Coleção de Cultura André Toselo (CCT 7668) foi utilizada. Para a reativação foi realizado repiques e incubados por 48 h a 25ºC em meio ágar extrato de malte e levedura YM (3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de extrato de malte, 5 g/L de peptona e 10 g/L de glicose). Após foi realizada ressuspensão celular (pré inóculo) em 1 mL de água peptonada (0,1%) e adicionada em 9 mL no meio YM por 48 h a 25ºC. O inóculo foi preparado em frascos agitados de 250 mL com 90 mL do meio de cultivo YM modificado (PARAJÓ; VÁZQUEZ, 1998), e adicionado 10 mL do pré inóculo, sendo incubado a 25°C, 150 rpm por 48 h ou tempo necessário para atingir no mínimo 1x108 células.mL-1, contadas em câmara de Neubauer (MICHELON et al., 2012). Os cultivos foram realizados em frascos agitados de 500 mL com 225 mL do meio de produção agroindustrial, o pH inicial de 6,0, acrescidos de 10% de inóculo, iniciando com 1x107 células.mL-1, a 25ºC, 150 rpm por 168 h (SILVA, 2009), sendo realizado o acompanhamento de biomassa e carotenoides a cada 24 h. A bioprodução de carotenoides foi estudada analisando os efeitos da composição do meio de cultivo agroindustrial água de maceração de milho (3,5 a 9,5 g/L ) e melaço de cana de açúcar (10 a 50 g/L ) através de um delineamento composto central 2², tendo como repostas a máxima concentração de carotenoides volumétricos em cada ensaio e neste mesmo tempo de processo a concentração de biomassa e carotenoides específicos alcançada.A concentração de biomassa ao longo do processo foi estimada pela absorbância a 620 nm, através de curva padrão previamente construída (CHOI; PARK, 2003).Para a determinação da concentração de carotenoides, a biomassa foi seca por 48 h a 35°C, posteriormente macerada com gral e pistilo e padronizada em peneira com mesh 115 (CIPOLATTI, 2012) e congeladas por 48 h a -18°C (FONSECA et al., 2011). O processo de rompimento celular com dimetilsulfóxido foi utilizado (MICHELON et al., 2012), sendo a extração feita com acetona, e o procedimento de ruptura repetido até o branqueamento total das células. Aos sobrenadantes adicionou-se 10 mL de solução de NaCl 20% (m.v-1) e 10 mL de éter de petróleo. Após a fase apolar foi filtrada com NaSO, originando os extratos carotenogênicos (MICHELON et al., 2012). A determinação da concentração de carotenoides totais nos extratos foi realizada em espectrofotômetro a 448 nm, sendo expresso em termos de seu carotenoide majoritário (CIPOLATTI, 2012), β-caroteno em éter de petróleo com absortividade específica de 2592, de acordo com Davies (1976).Os dados foram tratados com auxílio de Statistica 5.0, a 95% de nível de confiança (p < 0,05). A análise de variância foi utilizada para estimar os parâmetros estatísticos significativos para a construção de modelos empíricos codificados e as superfícies de resposta (RODRIGUES;IEMMA, 2012)
Resultado e discussão
As variáveis independentes codificadas e com os seus respectivos valores reais, concentração de melaço e concentração de água de maceração de milho, bem como as respostas avaliadas (variáveis dependentes) concentração de biomassa, carotenoides específicos e volumétricos variaram de 2,69 g/L (ensaio 1) a 8,73g/L (ensaio2), 110,8 µg/g (ensaio 9) a 177,9 µg/g (ensaio 1) e 407 µg/L (ensaio 3) a 1077 µg/L (ensaio 4), respectivamente (Figura 1).Com a finalidade da construção de modelos empíricos codificados (Equação 1 e Equação 2) para prever as respostas em função da concentração de melaço e água de maceração de milho foram realizadas análise de variância para biomassa, concentração específica e volumétrica de carotenoides (Figura 1). A Equação 1 foi descrita como Carotenoides volumétricos (µg/L) = 746,3 + 307,7xMelaço (Equação 1) e para a Biomassa (g/L)=5,72 + 2,52xMelaço (Equação 2). Em ambos os modelos os coeficientes de regressão não significativos (p>0,05) água de maceração de milho e a interação entre a água de maceração e o melaço foram adicionados ao resíduo da análise de variância. Os coeficientes de correlação da análise de variância (R) de 0,98 e 0,92, respectivamente, para carotenoides volumétricos e biomassa, foram obtidos demonstrando que os modelos propostos se ajustaram bem aos dados experimentais. Outro parâmetro avaliado foi a razão Fcalculado/Ftabelado de 22,9 para produção de carotenoides e 4,4 para biomassa, sendo assim considerados modelos preditivos, foi possível construir as superfícies de respostas (Figura 2). A concentração de carotenoides específicos não possibilitou a construção de modelos preditivos e significativos. Os desvios relativos entre os resultados experimentais e os preditos pelos modelos foram inferiores a 20% (Figura 1), demonstrando que as equações do modelo preveem bem o comportamento da produção volumétrica de carotenoides e da biomassa. O aumento da concentração da água de maceração de milho independente da concentração de melaço de cana de açúcar não influenciou na produção de carotenoides volumétricos (Figura 2a) e na concentração de biomassa (Figura 2b), conforme descrito pelas Equações 1 e 2, respectivamente. No entanto, o incremento na concentração do melaço em toda a faixa de concentração de água de maceração de milho estudada aumentou significativamente a produção carotenogênica e a biomassa microbiana.
Estes resultados estão de acordo com os ensaios 2 e 4, da Figura 1 que alcançaram as maiores produções de biomassa e carotenoides volumétricos deste estudo. Dessa forma para a maximização da produção de carotenoides a concentração de melaço deve ser 50 g/L e a água de maceração de milho de 3,5g/L, e nestas condições é possível alcançar aproximadamente 1000 µg/L de carotenoides volumétricos e 8 g/L de biomassa.
A maximização da produção de carotenoides no meio de cultivo agroindustrial proposto neste trabalho foi similar ao alcançado em meio YM (3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de extrato de malte, 5 g/L de peptona, 10 g/L de glicose) por Cipolatti (2012), utilizando o mesmo micro-organismo e as mesmas condições de processo, que obteve uma máxima produção de carotenoides de 1068 μg/L. Portanto, demonstrando que a utilização do meio agroindustrial, com substratos alternativos de menor valor agregado, pode viabilizar esta produção e minimizar os custos do processo.
Machado e Burkert (2015) utilizando o meio agroindustrial com 40 g/L de melaço e 6,5 g/L água de maceração de milho, nas mesmas condições de processo deste trabalho, porém, com a levedura Sporidiobolus pararoseus alcançaram 520,94 μg/L (73,19 μg/ g), resultados inferiores comparados a este trabalho com a R. mucilaginosa.
AMM= água de maceração de milho DR1= desvio relativo (%) para resposta biomassa DR2= desvio relativo (%) para resposta carotenoides volumétricos
Carotenoides em µg/L (a) e biomassa em g/L (b) em função da concentração de melaço e água de maceração de milho
Conclusões
A levedura Rhodotorula mucilaginosa foi capaz de produzir carotenoides com a utilização de um meio de cultivo agroindustrial formulado com melaço e água de maceração de milho. A concentração de melaço possuiu efeito significativo na produção carotenogênica e na biomassa, no entanto a concentração de água de maceração de milho não obteve efeito significativo. A maximização da produção obteve aproximadamente 1000 µg/L em carotenoides e 8 g/L de biomassa, no meio contendo 50g/L melaço e 3,5 g/L água de maceração de milho.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos órgãos de fomento: FURG, CNPq, CAPES, FAPERGS.
Referências
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