Plataforma eletroquímica para a detecção de DNA genômico do vírus da hepatite B em amostras reais

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Castro, A.C.H. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Soares, M.M.C.N. (INSTITUTO ADOLFO LUTZ) ; Madurro, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Brito-madurro, A.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA)

Resumo

Plataformas funcionalizados com filmes poliméricos têm se mostrado promissoras para o desenvolvimento de biossensores visando o diagnóstico de doenças. Neste trabalho foram utilizados eletrodos de grafite modificados com poli (4- aminofenol) (poli (4-AMF)) para a detecção do DNA genômico do vírus da hepatite B (VHB) em amostras de pacientes positivos para a hepatite B. Observou-se uma diferença nos valores médios de RCT de cerca de 2,75 vezes na presença das amostras positivas para a hepatite B em relação ao valor de RCT para o biossensor na ausência do alvo positivo. O biossensor produzido foi eficiente em detectar e discriminar concentrações diferentes do vírus extraído do sangue de pacientes com hepatite B.

Palavras chaves

Poli (4-aminofenol); Diagnóstico ; Hepatite B

Introdução

A hepatite B é uma infecção provocada pelo vírus da hepatite B (VHB), cujo material genético é uma molécula de DNA. Uma vez dentro do organismo, ele ataca os hepatócitos e se multiplica provocando a irritação e inflamação do fígado, podendo evoluir para um quadro clínico mais grave e a morte. É uma doença silenciosa e sexualmente transmissível. Estima-se que 240 milhões de pessoas estejam infectadas cronicamente (OMS, 2017) sendo esta doença responsável, no mundo, por aproximadamente 780.000 óbitos ao ano (KANWAL et al., 2015). Quando o diagnóstico é finalmente realizado, o paciente apresenta quadro clínico avançado dificultando o tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce da doença pode auxiliar na melhor terapêutica e controle da progressão da doença. Os métodos tradicionais de diagnóstico são realizados por meio de testes sorológicos por ELISA e testes de PCR (CHOU et al., 2016), porém possuem baixa sensibilidade e pode apresentar falsos positivos. O desenvolvimento de biossensores para diagnóstico de doenças apresentam diversas vantagens como o baixo custo, elevada seletividade e sensibilidade, detecção em tempo real e mais próximo dos pacientes usando pequeno volume de amostra, além de poder passar por um processo de miniaturização (JENSEN et al., 2013). As técnicas eletroquímicas são as que concentram o maior número de trabalhos realizados devido à facilidade no processo, resultados rápidos e confiáveis (CASTRO et al., 2014). Neste trabalho desenvolvemos uma plataforma utilizando eletrodos de grafite sensibilizados com o poli (4-AMF) e imobilizado uma sonda especifica VHB (HEP1) para a detecção do DNA genômico extraído de amostra de pacientes acometidos pela doença utilizando espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE).

Material e métodos

As medidas eletroquímicas foram realizadas em células de três compartimentos, acoplados a um potenciostato Autolab PGSTAT 302N. Um disco de grafite com 6 mm de diâmetro foi usado como eletrodo de trabalho. Placa de platina como eletrodo auxiliar e eletrodo de prata-cloreto de prata (Ag/AgCl (KCl 3M) como eletrodo de referência. Os espectros de impedância eletroquímica foram obtidos em solução de ferrocianeto de potássio K4[Fe(CN)6] 5,0 mmol.L-1, ferricianeto de potássio K3[Fe(CN)6] 5,0 mmol.L-1 contendo cloreto de potássio KCl 0,1 mol L-1. A biomolécula usada como sonda (HEP1) foi um oligonucleotídeo específico para a detecção do DNA viral de sequência: 5’-GAGGAGTTGGGGGAGCACATT-3’. O DNA genômico foi obtido do Instituto Adolfo Lutz e extraído automaticamente pelo extrator m2000sp da ABBOTT. As amostras de DNA foram diluídas em tampão SSC (cloreto de sódio 0,3 mol L-1, citrato de sódio 0,03 mol L-1; pH: 7,3) e quantificadas usando o Biodrop. A sensibilização da superfície foi realizada de acordo com Vieira e colaboradores (VIEIRA et al; 2006). A imobilizacao do HEP1 (15 µL, 63 µ mol L- 1) foi feita por gotejamento de sobre o eletrodo modificado com poli(4-AMF). O eletrodo foi imerso em solução de bloqueio (albumina bovina 0,5%) por 2 horas. A seguir, foi adicionado 18 µL das amostras de DNA genômico, desnaturados termicamente, e promoveu-se o processo de hibridização (20 min. a 55 ºC). As superfícies foram lavadas com tampão fosfato, secas e conduzidas para a detecção usando a EIE (Frequência: 100 KHz a 10 mHz, Amplitude: 10 mV; potencial aplicado: + 0,23 V. A solução foi daerada por 45 minutos).

Resultado e discussão

A EIE fornece informações importantes sobre a impedância de processos superficiais, incluindo a detecção do processo de hibridização, sendo bastante eficiente para avaliar a taxa de transferência eletrônica nos eletrodos, na presença de espécies redox em solução. Uma das possíveis representações dos dados é feita por meio do diagrama de Nyquist, em que a presença de semicírculos indica componentes resistivos nos sistemas. Os diagramas de Nyquist para eletrodos de grafite/poli(4-AMF)/HEP1 e grafite/poli(4- AMF)/HEP1:DNA genômico são mostrados na Figura 1 (A) juntamente com o gráfico de barras comparando os valores de resistência a transferência de carga (RCT) de 5 amostras positivas para a hepatite B (Figura 1 (B)). Sabe-se da literatura que o aumento nos valores de RCT indicam o aumento da quantidade de DNA genômico do VHB sobre a superfícies dos eletrodos (MASHHADIZADEH et al., 2016). Observou-se uma diferença nos valores médios de RCT de cerca de 2,75 vezes na presença das amostras positivas para a hepatite B em relação ao valor de RCT para o biossensor na ausência do alvo positivo. Desta forma, o sensor mostrou-se seletivo, específico, permitindo reconhecer diferentes concentrações do DNA alvo, em um sistema livre de marcação. Os resultados comprovam a eficiência do biossensor em identificar e quantificar diferentes concentrações do material genético sobre a plataforma desenvolvida.

Diagramas de Nyquist do HEP1 e a hibridização com DNA genômico


Gráfico de barras comparando os valores de resistência a transferência de carga (RCT) de 5 pacientes doentes.

Conclusões

A plataforma desenvolvida foi capaz de identificar o alvo genômico complementar em amostras reais obtidas de plasma humano. Apresenta como vantagens, baixo custo, detecção em tempo real e características propícias para experimentos em amostras reais. Além de que todo sistema foi construído sobre uma plataforma capaz de ser miniaturizada utilizando tintas de grafite serigrafadas sobre uma placa de cerâmica. Estes resultados são promissores para o desenvolvimento de um biossensor para o diagnóstico da hepatite B.

Agradecimentos

CAPES, CNPq, FAPEMIG, PROPP-UFU e PPGMQ-MG

Referências

CASTRO, A. C. H.; FRANCA, E. G.; DE PAULA, L. F.; SOARES, M. M. C. N.; GOULART, L. R.; MADURRO, J. M.; BRITO-MADURRO, A. G. Preparation of genosensor for detection of specific DNA sequence of the hepatitis B virus. Applied Surface Science, 314, 273-279, 2014.

CHOU, S. L.; CHOU, M. Y.; WANG, Y. H.; KUO, F. C.; KAO, W. F. The impact of chronic carrier of hepatitis B virus on liver function in a 7-day ultramarathon race. Journal of the Chinese Medical Association, 79, 4, 179-84, 2016.

JENSEN, P. W.; FALCONI, M.; KRISTOFFERSEN, E. L.; SIMONSEN, A. T.; CIFUENTES, J. B.; MARCUSSEN, L. B.; FROHLICH, R.; VAGNER, J.; HARMSEN, C.; JUUL, S.; HO, Y. P.; WITHERS, M. A.; LUPSKI, J. R.; KOCH, J.; DESIDERI, A.; KNUDSEN, B. R.; STOUGAARD, M. Real-time detection of TDP1 activity using a fluorophore-quencher coupled DNA-biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 48,230-237, 2013.

KANWAL, F.; EL-SERAG, H. B.; ROSS, D. Surveillance for hepatocellular carcinoma: can we focus on the mission? Clinical Gastroenterolory Hepatology, 13, 4, 805-7, 2015.

MASHHADIZADEH, M. H., TALEMI, R. P. Synergistic effect of magnetite and gold nanoparticles onto the response of a label-free impedimetric hepatitis B virus DNA biosensor. Materials science & engineering. C, 59, 773-781, 2016.

OMS - http://www.who.int/en/ acessado em 10/08/2017.

VIEIRA, S. N.; FERREIRA, L. F.; FRANCO. D. L.; AFONSO, A. S.; GONÇALVES, R. A.; BRITO –MADURRO, A. G.; MADURRO. J. M. Electrochemical modification of graphite electrodes with poly(4-aminophenol), Macromolecular. Symposia, 245-246, 236-242, 2006.