Detecção de transcrito codificante da telomerase em Melipona scutellaris

Resumo

A telomerase é uma enzima que adiciona repetições de seqüências de DNA às extremidades dos cromossomos, impedindo assim o encurtamento dos mesmos. A atividade da telomerase está associada ao estado proliferativo das células, desenvolvimento organizacional e envelhecimento. O objteto de estudo desse trabalho foi abelhas Melipona scutellaris. Os resultados mostram a presença de transcritos do gene codificante da enzima telomerase, detectada por meio de RT- PCR, seguido de análise em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo das amostras de larvas de terceiro estágio, terceiro instar (L3-3); pupa de corpo branco e olho rosa de operárias (PpW) e forrageira (F) de abelhas sem ferrão a fim de entender melhor o processo de envelhecimento e doenças relacionadas nesses insetos.

Palavras chaves

Telomerase; Melipona scutellaris; Telômero

Introdução

As abelhas sem ferrão são abelhas sociais pertencentes à família Apidae e à tribo Meliponini. Vivem em regiões tropicais e ocupam a maior parte da América Latina (NOGUEIRA-NETO, 1997). A abelha de interesse nesse trabalho é a Melipona scutellaris, abelha indígena, típica do nordeste brasileiro, conhecida pelos nomes populares de uruçu, uruçu-nordestina, uruçu-boi, uruçu-do- caboclo. Esses insetos possuem metamorfose completa em seu ciclo de vida, passando pelo estágio de embrião, larva e pupa antes de originar um imago, indivíduo adulto, sendo assim, esses insetos são holometábolos (TRUMAN; RIDDIFORD, 1999). Os telômeros apresentam três funções principais. Primeiro, a extensão constante das repetições teloméricas pela telomerase impede o truncamento das extremidades dos cromossomos durante a replicação do DNA. A perda da atividade da telomerase e, portanto, as repetições teloméricas, está associada à senescência celular e ao envelhecimento, enquanto as células cancerosas tipicamente têm atividade de telomerase elevada envolvida em sua imortalidade. Em segundo lugar, os telômeros têm uma estrutura de DNA fechada em seus extremos e estão ligados por várias proteínas, evitando o reconhecimento do telômero como um fim do cromossomo quebrado e junção final inapropriada para outros cromossomos. Em terceiro lugar, algumas das proteínas de ligação ao telômero medeiam sua localização no núcleo eucariótico, mais proeminente em sua localização na membrana nuclear oposta aos centrômeros (COWAN et al., 2001). Logo, o presente trabalho buscou detectar a presença de transcritos do gene codificante da telomerase, por meio de RT- PCR, nos estágios de larva de terceiro estágio, terceiro instar (L3-3); pupa de corpo branco e olho rosa de operárias (PpW) e forrageira (F) de abelhas sem ferrão da espécie M. scutellaris a fim de entender melhor o processo de envelhecimento e doenças relacionadas nesses insetos.

Material e métodos

Foi utilizado como material biológico abelhas sem ferrão da espécie Melipona scutellaris nos estágios de larva L3-3 (larva do terceiro estágio, terceiro instar); estágio de pupa PpW (pupa de corpo branco e olho rosa); e abelha na fase adulta forrageira (F). A extração de RNA total foi executada pelo método do TRIZOL (solução comercial de fenol e isotiocianato de guanidina para isolamento de RNA total, Ambion – Life Technologies), seguindo as recomendações do fabricante. O RNA foi quantificado em Nanodrop (ND-1000 Spectrophotometer) a 260 nm. Para a síntese de cDNA (RT) foi utilizada a enzima M-MLV transcriptase reverse (Promega) e Oligo dT (15) (Invitrogen), seguindo as instruções dos fabricantes. A segunda fita foi sintetizada por PCR com o uso de primers específicos para os genes alvo. A qualidade do cDNA foi testada, com transcrito do gene codificador da proteína ribossomal 49, rp49 (GenBank accession number AF441189) que além de um fragmento de 150 pb, amplifica um de 240 pb no caso de contaminação com DNA genômico (LOURENÇO et al., 2008). Os primers utilizados foram desenhados utilizando o programa Oligo Explorer (Version 1.2). Os primers foram desenhados com base nas sequências encontradas por homologia no genoma de M. quadrifasciata, uma vez que esse organismo apresenta maior homologia com as abelhas M. scutellaris. Por fim, a migração eletroforética foi realizada em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo e acompanhada de marcador de peso molecular (50pb) para avaliação do tamanho do fragmento obtido.

Resultado e discussão

A amplificação, por meio de RT-PCR, do transcrito codificante de telomerase, seguido de eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo, utilizando marcador de 50pb (M50pb) é mostrada na Figura 1. CN na Figura 1 é controle negativo do experimento. É possível observar a detecção de transcritos do gene codificante da telomerase nos estágios de larva (L3-3), pupa de corpo branco e olho rosa de operárias (PpW) e forrageira (F). Verificou-se que todas as amostras analisadas possuem a presença de transcritos codificantes da telomerase (banda de 145 pb indicado com seta branca). Nesse sentido, os resultados indicam que a presença de transcritos condificantes da telomerase nas amostras analisadas mostram que os primers desenhados para o presente trabalho obteve boa amplificação nos estágios L3-3, PpW e F em Melipona scutellaris. Compravando, assim, que há transcritos do gene codificador de telomerase em todos os estágios estudados no presente trabalho, conforme previamente observado por Michala Korandová e Radmila Čapková Frydrychová (2015) para a atividade desta enzima em abelhas da espécie Apis mellifera. Foi relatado análise da atividade da telomerase e do comprimento dos telômeros na abelha de espécie Apis mellifera. Neste caso, a atividade da telomerase mostrou-se ser regulada durante o desenvolvimento e de maneira casta-específica nesta espécie. Em A. mellifera, observou-se que para larvas de operárias a atividade da telomerase diminuiu para 10% do seu nível comparando-se com o nível identificado em embriões e manteve-se baixa durante os estádios de pupa e adulto de operárias. No entanto, teve sua atividade aumentada atingindo 70% do nível de embrião em rainhas (KORANDOVÁ & FRYDRYCHOVÁ, 2015). Ademais, está bem estabelecido na literatura que a atividade da telomerase está fortemente associada ao estado de proliferação das células (WYATT et al., 2010; LIN et al., 2012), logo, há indícios de que a telomerase desempenha funções importantes no desenvolvimento da abelha sem ferrão Melipona scutellaris, assim como Michala Korandová e Radmila Čapková Frydrychová (2015) demonstrou em A. mellifera.

Figura 1

Eletroforese da amplificação do transcrito codificante da telomerase por RT‐PCR em abelhas M. scutellaris.

Conclusões

Os primers específicos desenhados para a identificação de transcritos do gene codificante da enzima telomerase possuem boa amplificação nos seguintes estágios: larvas de terceiro estágio, terceiro instar; pupa e forrageira de abelhas sem da espécie Melipona scutellaris. Além disso, os transcritos do gene codificante da telomerase foram identificados em todos os estágios analisados no presente trabalho.

Agradecimentos

CAPES, CNPQ, FAPEMIG e LABGEN UFU.

Referências

COWAN, C.R. et al. The polar arrangement of telomeres in interphase and meiosis. Rabl organization and the bouquet. Plant Physiol, p. 532–538, 2001.
KORANDOVÁ, M.; FRYDRYCHOVÁ, R.Č. Activity of telomerase and telomeric length in Apis mellifera. Chromosoma, 2015. DOI 10.1007/s00412-015-0547-4
LIN, J. et al. Telomeres and lifestyle factors: roles in cellular aging. Mutat Res, p. 85–89, 2012.
LOURENÇO, A. P. et al. Validation of reference genes for gene expression studies in the honey bee, Apis mellifera , by quantitative real-time RT-PCR. Apidologie, v. 39, n. 3, p.372- 385, 2008.
NOGUEIRA-NETO, P. 1997. Vida e criação de abelhas indígenas sem ferrão.
São Paulo, SP: Nogueirapis. 445p.
TRUMAN, J.; RIDDIFORD, L. The origins of insect metamorphosis. Nature, v. 401, n. 6752, p. 447-52, 1999.
WYATT, H.D.M. et al. InTERTpreting telomerase structure and function. Nucleic Acids Res, p. 5609–5622, 2010.