Avaliação da produção de lipase a partir do fungo filamentoso Rhizopus IPEC 18/02 utilizando substrato alternativo

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Santos, T.C. (UESB) ; Ribeiro, D.S. (UESB) ; Teixeira, J.M. (UESB) ; Santana, R.A. (UESB) ; Serafim, E.J. (UESB) ; Ferreira, A.N. (UESB) ; Mota, K.I.A. (UESB) ; Franco, M. (UESC) ; Valasques Jr, G.L. (UESB) ; Nascimento Jr, B.B. (UESB)

Resumo

Este trabalho avaliou através de um planejamento Doehlert a potencialidade de uma linhagem isolada do fungo filamentoso Rhizopus(IPEC 18/02)em produzir enzimas utilizando a planta Mandacaru (Cereus jamacaru) como substrato alternativo através da fermentação em meio sólido. O extrato bruto obtido após a fermentação foi avaliado através da atividade enzimática. O Rhizopus IPEC 18/02. Os resultados mostraram que a região ótima para tempo e temperatura média para produção da enzima foi de 96 a 130 horas e 24 a 33°C respectivamente. A maior atividade enzimática encontrada foi de 89,9 ± 0,007 UA.

Palavras chaves

Fermentação; Mandacaru; Extrato bruto

Introdução

As lipases (triacilglicerol éster hidrolases, E.C.3.1.1.3) são enzimas capazes de catalisar a hidrólise de triacilgliceróis (gorduras e óleos) liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol, apresentam um potencial industrial significativo devido à elevada atividade catalítica (Singh, 2011). O uso dessas enzimas em escala industrial ainda é limitado em função dos elevados custos de produção. Assim, estudos sobre a utilização de diferentes microrganismos, suplementos e substratos para a produção de enzimas podem contribuir no sentido de encontrar combinações ideais para obtê-las com altos rendimentos utilizando substratos alternativos e condições operacionais que possibilitem a redução dos custos do processo de produção em escala industria (Pandey, 2000; Pandey, 2003; Novaki, et al. 2010. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho é otimizar a produção de lipase a partir do fungo filamentoso Rhizopus IPEC 18/02 utilizando como substrato alternativo a planta Mandacaru (Cereus jamacaru) através da fermentação em estado sólido.

Material e métodos

O planejamento utilizado no presente trabalho foi o Doehlert composto por três variáveis e o ponto central em triplicata. O Mandacaru (Cereus jamacaru) foi utilizado na fermentação em estado sólido como meio de cultivo do fungo Rhizopus IPEC 18/02 para avaliação da atividade enzimática. O substrato foi coletado na cidade Jequié, seco em estufa de secagem e esterilização SOLAB a 70°C por 24 horas, a umidade obtida após a secagem foi estabelecida a 92,7%. O resíduo foi triturado em moinho tipo Wiley com granulométrica aproximada de 2mm.Na fermentação foram empregados erlenmeyers como biorreatores, com 10 g de substrato e inoculou-se a solução de esporos na concentração de 107 esporos/g de substrato. Ao final da fermentação, foi adicionado 5 mL de tampão fosfato de potássio (100 mM, pH 7,0) por grama de torta fermentada para obtenção do extrato bruto. Para avaliação da atividade enzimática de lipase em tubo de ensaio foi adicionado 500 µL da solução A (15 mg de P-NPP com 10 µL de álcool isopropílico) com 4,5 mL da solução B(4,0 g de triton; 0,4 g de goma arábica e 200 mL de tampão fosfato pH 7,0) e 250 µL do extrato enzimático e para o branco 500 µL álcool isopropílico com 4,5 mL da solução B e 250 µL do extrato enzimático, procedimento realizado em triplicata para cada amostra. Os tubos de ensaio foram submetidos a banho maria a 40°C por 10 minutos em seguida foi feita a leitura em espectrofotômetro a 410 nm. A unidade de atividade enzimática (UA) foi definida como a quantidade de enzima capaz de hidrolisar 1μmol/mL/min de produto.

Resultado e discussão

O maior valor obtido para a atividade enzimática da enzima lipase foi de 89,9 ± 0,007 UA, com uma temperatura de 35°C e umidade de 70%, no tempo de 96 horas. Com base na Análise de Variância (ANOVA) a qualidade do modelo foi verificada através do coeficiente de variância R2 que foi de 0,94, indicando que 94% dos valores experimentais podem ser explicados pelo modelo matemático utilizado e também pela falta de ajuste que mede a falha do modelo, ao qual foi não significativa, apresentando o F calculado menor que o F tabelado. Já na regressão, o F calculado (10,88) foi maior que o F tabelado(4,81). O modelo foi estatisticamente significativo, a 95% de confiança. A enzima lipase teve como variáveis significativas tempo e temperatura, a região ótima para a produção desta enzima se encontra em um tempo de aproximadamente 96 horas a 130 horas e temperatura de 24 a 33°C. O tempo encontrado para a maior produção de lipase pode estar relacionado com a fase de crescimento que houve a maior absorção de nutrientes pelo microrganismo, presentes no farelo do mandacaru. Quando se reduz a quantidade de nutrientes disponíveis no meio, consequentemente há uma queda na geração de produtos(Biazus et al, 2006). A temperatura é um fator crítico do processo de FES, devido ao acúmulo do calor metabólico gerado, pois, além da dificuldade de mistura do meio sólido, a maioria dos substratos utilizados possui baixa condutividade térmica, o que pode gerar gradientes de temperatura no biorreator. Além disso, para os fungos filamentosos, a temperatura influencia diretamente a germinação dos esporos, crescimento e formação de produtos (Pinto et al, 2006). O pH 7, utilizado na fermentação e extração auxiliou a produção da enzima, como descrito por Reinehr (2014).

Tabela2. Análise de variância (ANOVA) pela Matriz Doehlert em 95 % de intervalo de confiança, para a enzima lipase.


Figura 1. Superfície de resposta e curva de nível para a enzima lipase tendo como variável significativa tempo e temperatura.

Conclusões

De acordo com os estudos, o fungo filamentoso Rhizopus IPEC 18/02 utilizando como substrato alternativo a planta Mandacaru (Cereus jamacaru) através da fermentação em estado sólido foi capaz de produzir a enzima lipase com os resultados obtidos neste trabalho, notamos que o microrganismo Rhizopus no meio contendo o substrato mandacaru, é adequado para a produção de enzimas utilizando a fermentação em estado sólido e esses estudos potencializam ações para possível aplicações destes extratos.

Agradecimentos

Ao CNPq, Fapesb e UESB

Referências

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Novaki A.; Hasan M. D. S.; Kadowaki K. M.; Andrade D. Produção de Invertase por Fermentação em Estado Sólido a partir de Farelo de Soja.ENGEVISTA, V. 12, n. 2. p. 131-140, 2010.
Pinheiro T. L. F. Produção de lipases por fermentação em estado sólido e fermentação submersa utilizando Penicilliumverrucosum como microrganismo. Dissertação de mestrado, programa de mestrado em engenharia de alimentos da URI – Campus de Erechim, 2006.
Pandey, A. et al. New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and pruducts.Process Biochemistry, v. 35, n. 10, p. 1153-1169, 2000.
Pandey, A. Solid-state fermentation.Biochemical Engineering Journal, v. 13, p. 81-84, 2003.
Pinto, G. A. S.; Brito, E. S.; Silva, F. L. H.; Santos, S. F. M.; Macedo, G. R. Fermentação em estado sólido uma alternativa para o aproveitamento e valorização de resíduos agroindustriais. Revista de Química Industrial, n.724, p.17-20, 2006.
Reinehr, C. O.;Rizzardi, J.; Silva, M. F.; Oliveira, D.; Treichel, H.;Colla, L. M. Produção de lipases de Aspergillusniger e Aspergillusfumigatusatravés de fermentação em estado sólido, avaliação da especificidade do substratoe seu uso em reações de esterificação e alcoólise. Química Nova, v. 37, p. 454-460,2014.
Singh, A. K., et al. ApplBiochemBiotechnol, 2011.