Imobilização em poliuretano de fungo filamentoso produtor de lipase

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Amaral de Faria Silva, L. (UESB) ; Florêncio Filho, D. (UESB) ; Ferreira Alves, M. (UESB) ; Almeida de Carvalho, S. (UESB)

Resumo

A imobilização de células íntegras de fungos filamentosos capazes de produzirem lipases intracelulares vem sendo investigada com o intuito de reduzir os custos em processos enzimáticos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a imobilização de células de fungo filamentoso produtor de lipase do gênero Colletotrichum sp. Para isso, o processo de imobilização foi realizado em cubos de poliuretano, por até 96 horas, e a atividade lipásica do filtrado (lipase extracelular) e das células imobilizadas (lipase intracelular) foram determinadas por método titulométrico. Foi observada atividade lipásica máxima no filtrado após 72 horas de fermentação, enquanto atividade lipásica máxima das células imobilizadas foi obtida em 48 horas.

Palavras chaves

lipase intracelular; biocatálise; Colletotrichum sp.

Introdução

As lipases, em particular, são enzimas que ocupam um lugar de destaque entre os biocatalisadores e possuem muitas aplicações, motivo este que faz crescer significativamente sua participação no mercado mundial de enzimas industriais (COLEN et al., 2006; FARIA, 2010). As lipases podem ser comumente encontradas na natureza e são obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Observa-se que a preferência para a utilização industrial recai sobre as lipases de origem microbiana, sendo, frequentemente, mais úteis que as de origem vegetal e animal. Tal fato pode ser justificado, entre outras razões, pela variedade de micro-organismos, pela possibilidade de manipulação genética, e pelo rápido crescimento dos micro-organismos em meios relativamente de baixo custo (COLEN et al., 2006; SILVA et al., 2009; AÇIKEL et al., 2010; FARIA, 2010). O potencial biotecnológico das lipases relaciona-se ao fato de catalisar não apenas a hidrólise, mas também, reações inversas de esterificação. Estas enzimas catalisam a hidrólise, em meio aquoso, de triacilgliceróis. Observa-se, no entanto, que em condições de baixa quantidade de água, as lipases promovem a catálise da reação inversa, ou seja, da reação de esterificação. A versatilidade das lipases em catalisar diferentes tipos de reação amplia consideravelmente as aplicações comerciais e tecnológicas destas enzimas e, por isso, também são utilizadas como biocatalisadores ideais em química orgânica, química fina, nas indústrias farmacêutica, agroquímica e oleoquímica, na produção de aditivos alimentares e na produção de biodiesel (FARIA, 2010; BONINE, 2011; SOARES, 2012). Apesar das vantagens evidentes do uso de lipases nesses processos, existem ainda problemas a serem resolvidos, principalmente do ponto de vista econômico, pois a produção e purificação da enzima livre aumenta o custo, o que pode limitar sua aplicação como um catalisador (BONINE, 2011). Com intuito de diminuir esse inconveniente, as lipases intracelulares vêm sendo investigadas, pois sua aplicação pode reduzir consideravelmente os custos de um processo enzimático. Diante disso, diversos estudos estão sendo direcionados para a imobilização de células íntegras de fungos filamentosos capazes de produzirem lipases intracelulares que se encontram ligadas à membrana celular. Além da redução do custo, os processos que envolvem células imobilizadas como biocatalisadores apresentam vantagens, como a relativa facilidade de ampliação de escala, possibilidade de utilizar o biocatalisador mais de uma vez, armazenamento das células imobilizadas por longos períodos, facilidade de manuseio e transporte, maior estabilidade operacional, e maior resistência a perturbações ambientais (ELIZEI et al., 2014; BONINE, 2011). Para se utilizar células íntegras lipolíticas como biocatalisadores de uma forma conveniente, as células devem ser imobilizadas de tal maneira que se assemelhem a catalisadores sólidos utilizados convencionalmente em reações químicas. Entre os diversos métodos de imobilização disponíveis, a técnica que utiliza suporte tem vantagens sobre outros métodos para aplicações industriais, dentre as quais se destacam a simplicidade de imobilização da biomassa, o crescimento natural do micro-organismo e o baixo custo de produção (SOARES, 2012; YOSHIDA, et al., 2012). Entre os suportes adequados para a imobilização de biocatalisadores, os poliuretanos (PU’s) vêm se destacando como uma matriz promissora para imobilizar não somente enzimas, mas também as células microbianas íntegras (SOARES, 2012). Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi avaliar a imobilização de células de fungo filamentoso produtor de lipase do gênero Colletotrichum sp.

Material e métodos

Micro-organismos: A cepa utilizada nesse trabalho pertencia ao gênero Colletotrichum sp. e foi mantida a 30°C em tubos slants de ágar batata e dextrose (PDA). Suporte: O suporte para imobilização consistiu em cubos de poliuretano de 0,5cm3. Antes de serem utilizados, os cubos foram lavados com metanol (1x) e com água destilada (3x), e secos. Imobilização das células: O processo de imobilização das células de Colletotrichum sp. foi conduzido em Erlenmeyers de 250mL com 50mL do meio de cultura contendo óleo de oliva como fonte principal de carbono (COLEN et al., 2006) e 30 cubos de poliuretano tratados e pesados. Os erlenmeyers foram então autoclavados e, após resfriamento, em cada um deles foram adicionados 5mL de suspensão de esporos do fungo Colletotrichum sp. (108 esporos/mL). Os conjuntos (erlenmeyer + meio de cultura + suspensão de esporos) foram incubados a 30°C e 150rpm, até 96 horas, sendo que três frascos (triplicata) foram retirados a cada 48 horas. Após o tempo de cultivo, cada grupo de cubos contendo as células imobilizadas foi separado do meio de fermentação, em condições estéreis, por filtração e lavados extensivamente com água destilada esterilizada para remover os componentes do meio e células não ligadas. Após estar seco, cada grupo de cubos foi pesado, também em condições estéreis, para determinação da biomassa seca. Dosagem da atividade lipásica: A dosagem da atividade lipásica das células imobilizadas e do filtrado foi determinada por método titulométrico, baseando-se no meio reacional descrito por Colen et al. (2006), contendo: 2,5ml de tampão Tris–HCl 0,1M e pH 8,0; 2,5ml de emulsão de óleo de oliva 25% (v/v) em solução de álcool polivinílico a 2%(v/v); substituindo o filtrado contendo a enzima, pela adição de 10 cubos de poliuretano com as células imobilizadas. A emulsão de óleo de oliva foi preparada, usando um dispersor ultra-turrax T25. A mistura reacional foi incubada a 30°C em agitador orbital. Após 10 minutos de reação, os respectivos cubos foram separados da mistura reacional, sobre a qual foram adicionados 10mL da solução acetona/etanol (1:1 v/v) com a finalidade de paralisar a reação. Os ácidos graxos livres foram dosados por titulação com NaOH 0,05N, usando timolftaleína como indicador. Cubos de poliuretano com células imobilizadas foram esterilizados e usados como controle. Uma unidade de lipase foi definida como a quantidade de enzima que liberou 1 micromol (μmol) de ácidos graxos por minuto, nas condições padronizadas do teste. E a atividade específica foi definida como unidades de atividade por 1g de biomassa seca.

Resultado e discussão

A partir da Figura 1, pode-se perceber que a cepa estudada é capaz de produzir lipase extracelular, representada pela atividade lipásica no filtrado (figura 1A), e intracelular, pela atividade lipásica nas células imobilizadas em poliuretano (figura 1B). A capacidade de produzir lipase extracelular por espécie de fungo filamentoso pertencente ao gênero Colletotrichum sp também foi demonstrada por Colen e colaboradores (2006) e Faria (2010), ao realizarem fermentação submersa. Nota-se que a atividade lipásica máxima das células imobilizadas, ou seja, lipase intracelular, foi alcançada em 48 horas de fermentação. Ao passo que a atividade máxima de lipase extracelular, quantificada no filtrado, ocorreu em 72 horas. Silva e colaboradores (2009) também encontraram atividade lipásica com células imobilizadas em poliuretano, por 72 horas, para a espécie Penicilium citrinum. Esses mesmos autores, verificaram também que o suporte de poliuretano apresenta satisfatória aderência para as células fúngicas testadas. Soares (2012) verificou que as espumas de poliuretano apresentaram boas características para a imobilização de células do fungo Mucor circinelloides e que a biomassa imobilizada nessas matrizes foram capazes de produzir lipase, apresentando boas propriedades catalíticas. Os dados sumarizados na Tabela 1 trazem os dados de biomassa seca aderida ao suporte, indicando que a cepa testada de Colletotrichum sp. foi eficiente em termos de produção de células (biomassa) fúngicas aderidas ao suporte, atingindo um valor de 4,21g de biomassa seca em 96h de cultivo. Entretanto, em 96 horas de cultivo não foi verificada maior atividade lipásica no filtrado e nem nas células imobilizadas, como já demonstrado. Na verdade, através dos resultados de atividade específica, fica demonstrado que o melhor tempo de fermentação para produção de lipase por células de Colletotrichum sp imobilizadas em poliuretano é, realmente, 48 horas.

A) Atividade lipásica obtida no filtrado. B) Atividade lipásica obtida no derivado imobilizado


Valores máximos de atividade no filtrado e no derivado imobilizado a partir do tempos de cultivo.

Conclusões

A imobilização das células fúngicas de Colletotrichum sp. foi possível, empregando como suporte esponjas de poliuretano, e permitiu a produção de lipase intracelular, cuja atividade máxima foi alcançada após 48 horas de fermentação.

Agradecimentos

Referências

AÇIKEL, U.; ERŞAN, M.; AÇIKEL, Y.S. Optimization of critical medium components using response surface methodology for lipase production by Rhizopus delemar. Food Bioprod. Proc., v. 8, p. 31-39, 2010.

BONINE, B.M. Produção de lipase pelo fungo Myceliophthora sp. f 2.1.4, caracterização e imobilização da solução enzimática bruta. São José do Rio Preto: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista. 2011. 84p. (Dissertação, Mestrado em Microbiologia).

COLEN, G.; JUNQUEIRA, R.G; MORAES-SANTOS, T. Isolation and screening of alkaline lipase-producing fungi from Brazilian savanna soil. World J. Microb. Biotech., v. 22, p. 881–885, 2006.

FARIA, L.A. Hidrólise do óleo da amêndoa da macaúba com lipase extracelular de Colletotrichum gloesporioides produzida por fermentação em substrato líquido - Belo Horizonte: Faculdade de Farmácia da UFMG. 2010. 147p. (Dissertação, Mestrado em Ciência de Alimentos).

SILVA, G.S.; BRUNO, L.M.; CASTRO, H.F. Seleção e imobilização de fungos filamentosos produtores de lipase intracellular. In: XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos. Natal/RN. 2009.

SOARES, M.S. Síntese e caracterização de espumas de poliuretano para imobilização de células íntegras e aplicação na síntese de biodiesel – Lorena: Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. 2012. 119p. (Dissertação, Mestrado em Ciências).

ELIZEI, V.G.; CHALFOUN, S.M.; BOTELHO, D.M.S.; REBELLES, P.P.R. Imobilização de fungos lamentosos com potencial para uso agroindustrial. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.81(2), p. 165-172, 2014.

YOSHIDA, A.; HAMA, S.; TAMADANI, N.; FUKUDA, H.; KONDO, A. Improved performance of a packed-bed reactor for biodiesel production through whole cell biocatalysis employing a high-lipase-expression system. Biochemical Engineering Journal, v.63, p.76-80, 2012.