Detecção eletroquímica do DNA de Alicyclobacillus acidoterrestris em suco de laranja

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Flauzino, J.M.R. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; da Silva, J.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; dos Santos, J.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, A.G.B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA) ; Madurro, J.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA)

Resumo

Neste trabalho foi desenvolvido um bioeletrodo para a detecção do DNA genômico de Alicyclobacillus acidoterrestris, uma bactéria associada à deterioração do suco de laranja, do qual o Brasil é o maior produtor mundial. Eletrodos de grafite foram modificados com um nanocompósito polimérico, sobre o qual foi imobilizado um oligonucleotídeo sonda, específico para A. acidoterrestris, que foi utilizado para a detecção do DNA presente num lisado celular da bactéria em uma amostra de suco de laranja, via detecção do intercalante do DNA Hoechst 33258 por voltametria de pulso diferencial. O genossensor desenvolvido foi utilizado com sucesso na detecção do DNA de A. acidoterrestris em uma amostra real de suco de laranja.

Palavras chaves

Alicyclobacillus; biossensor; suco de laranja

Introdução

O suco de laranja é o suco de fruta mais consumido no mundo. O Brasil possui grande destaque na produção mundial de suco de laranja, sendo o maior produtor e exportador mundial. Alicyclobacillus acidoterrestris é a principal bactéria contaminante desse alimento, pois é resistente a processos de pasteurização típicos, além de sobreviver em sucos ácidos por um grande período de tempo, uma vez que é capaz de formar esporos muito resistentes (HUNNIGER et al., 2015). O método padrão para a detecção de A. acidoterrestris é o plaqueamento e cultivo em meio de cultura (CHANG; PARK; KANG, 2013). Apesar de ser específico, o cultivo demora em média 48 h, o que não é atrativo em termos comerciais. Tendo isso em mente, a procura por novos métodos de detecção de A. acidoterrestris que sejam rápidos, baratos e precisos é muito atrativa para a indústria citrícola. Os genossensores eletroquímicos entram nesse nicho, com a proposta de desenvolvimento de dispositivos que sejam de fácil manuseio, para detecção de inúmeros analitos. Dentre os diversos intercalantes eletroquímicos do DNA, temos o Hoechst 33258, que se liga ao sulco menor do duplex do DNA, sendo assim um intercalante da dupla fita, não exibindo afinidade pela simples fita de DNA (BUSTO et al., 2015). Tendo em vista a importância do suco de laranja para o mercado agrícola brasileiro, sendo A. acidoterrestris a principal bactéria contaminante do mesmo, e os métodos de detecção atuais demorados e dispendiosos, os genossensores eletroquímicos são uma alternativa rápida e barata, aliando a especificidade do DNA com a versatilidade das técnicas eletroquímicas. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi o desenvolvimento de um genossensor eletroquímico para a detecção de A. acidoterrestris em suco de laranja.

Material e métodos

Os eletrodos utilizados foram: eletrodo de trabalho de grafite (99,9999%, 6 mm de diâmetro), eletrodo de referência de Ag/AgCl e KCl (3 mol L-1) e eletrodo auxiliar de platina (área geométrica de 2 cm2). Em todos os experimentos foi utilizado um potenciostato da marca CH Instruments, modelo 760C. Os eletrodos de grafite foram modificados com óxido de grafeno reduzido eletroquimicamente, seguido pela eletropolimerização do ácido 3- hidroxibenzóico, produzindo-se assim um nanocompósito em sua superfície. Sobre esse eletrodo modificado foi imobilizado um oligonucleotídeo sonda específico para A. acidoterrestris, denominado ALIC1 com sequência (5’- CTGTGTTGATGTTGTTGGCG-3’). A superfície do eletrodo foi tratada com albumina de soro bovino, visando bloqueio de interações inespecíficas. Um lisado celular foi obtido por meio de uma cultura de A. acidoterrestris incorporada em um tampão de lise. Uma amostra de suco de laranja concentrado foi diluída em solução tampão fosfato de sódio a 5% (v/v), autoclavado e contaminado com o lisado celular numa proporção 1:1. Para a detecção eletroquímica, foram gotejados 15 µL da solução de suco contaminado sobre os eletrodos, mantendo- os em estufa a 70 ºC por 15 min para a hibridização das fitas complementares de oligonucleotídeos. Após esse tempo, a superfície dos eletrodos foi lavada com solução tampão fosfato de sódio e seca com nitrogênio ultrapuro. Foram adicionados 15 µL de solução aquosa de Hoechst 33258 (2x10-5 mol L-1) ao eletrodo e o mesmo foi incubado em temperatura ambiente por 15 min, seguido de lavagem. O pico de oxidação do Hoechst 33258 foi monitorado por meio da técnica de voltametria de pulso diferencial, em solução tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1, pH 7,4).

Resultado e discussão

A Figura 1 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial dos eletrodos em solução tampão fosfato de sódio na presença do intercalante Hoechst 33258, referentes à detecção indireta do DNA genômico presente no suco de laranja contaminado com o lisado celular de A. acidoterrestris. Nota-se um pico de oxidação do intercalante Hoechst 33258 mais proeminente na presença do lisado celular da bactéria A. acidoterrestris, sendo que ele foi em média 2,5 vezes maior do que na presença apenas do suco de laranja estéril, ficando evidente a diferença de corrente elétrica entre a presença do DNA genômico e sua ausência, comprovando sua detecção em amostra real. Dessa forma, o bioeletrodo foi capaz de detectar o DNA genômico da bactéria presente no suco, não sendo observada interferência dos componentes da amostra. Kobayashi e colaboradores reportaram o uso do Hoechst 33258 pela primeira vez como um indicador eletroquímico para a quantificação de DNA (KOBAYASHI et al., 2004). Já Zhao e colaboradores desenvolveram um microchip para a detecção eletroquímica do DNA utilizando Hoechst 33258 como um intercalante da dupla fita, mostrando sua aplicabilidade em genossensores (ZHAO et al., 2012). Além disso, o Hoechst 33258 é menos mutagênico e carcinogênico do que outros intercalantes da dupla fita de DNA (FERGUSON; DENNY, 1995). Uma vez que a detecção usual de A. acidoterrestris se dá por plaqueamento em meio de cultura, e o mesmo é demorado e dispendioso, esse novo método de detecção eletroquímico apresenta vantagens inerentes à sua aplicação, como rapidez, baixo custo e pouco volume de amostra, sendo assim atrativo para o uso em um laboratório de controle de qualidade, reservando- se os cuidados necessários ao se lidar com um intercalante de DNA, como o uso correto dos EPIs.

Voltamogramas de pulso diferencial dos eletrodos em solução tampão fosfato de sódio na presença do intercalante Hoechst 33258

Conclusões

A sonda foi imobilizada com sucesso na superfície do eletrodo, e o intercalante foi utilizado com êxito para detecção eletroquímica do DNA genômico da bactéria A. acidoterrestris. Foi verificado que as análises do genossensor não sofreram interferência na presença do suco de laranja, a amostra real na qual a bactéria está presente, estando apto para uso na cadeia produtora do suco. O presente bioeletrodo apresenta-se como a primeira plataforma adequada para atuar como biossensor eletroquímico para a detecção de A. acidoterrestris na literatura.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro do CNPq, FAPEMIG, CAPES e Rede Mineira de Química.

Referências

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KOBAYASHI, M.; KUSAKAWA, T.; SAITO, M.; KAJI, S.; OOMURA, M.; IWABUCHI, S.; MORITA, Y.; HASAN, Q.; TAMIYA, E. Electrochemical DNA quantification based on aggregation induced by Hoechst 33258. Electrochemistry Communications, v. 6, n. 4, p. 337-343, 2004.

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