EFEITO DA RAZÃO C/N NA PRODUÇÃO E VISCOSIDADE DE EXOPOLISSACARÍDEOS DE [i]Mesorhizobium loti[/i] Semia 816 A PARTIR DE PERMEADO DE SORO

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Mattos, M.V.C.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Trindade, R.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Munhoz, A.P. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Gautério, F.G.A. (UNIVERSIDADE DA REGIÃO DA CAMPANHA - CAMPUS BAGÉ) ; Burkert, C.A.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE)

Resumo

O objetivo do trabalho foi avaliar a substituição do manitol por permeado de soro no cultivo de Mesorhizobium loti Semia 816 visando produzir exopolissacarídeos (EPS), bem como determinar a viscosidade em diferentes razões C/N. Foi utilizado manitol (C/N 96,5) e permeado de soro (C/N 96,5 e 59,9) obtendo uma maior concentração de biomassa (0,72±0,04 g.L-1) em meio com permeado (C/N 59,9), diferindo significativamente (p<0,05) das demais condições. Maiores concentrações de EPS foram obtidas com manitol, não diferindo (p>0,05) do permeado na razão C/N de 59,9, sendo estas de 1,57±0,14 e 1,45±0,07 g/L, respectivamente. Todos EPS apresentaram comportamento pseudoplástico, sendo que o EPS obtido em meio com permeado (C/N 96,5) apresentou maior viscosidade inicial (15.142 cP).

Palavras chaves

Bactérias fixadoras de ni; Biopolímeros; Pseudoplasticidade

Introdução

Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos extracelulares, produzidos por alguns fungos e bactérias, sendo encontrados ligados à superfície das células ou excretados na forma de limo para o meio extracelular (BARBOSA et al., 2004). Dentre as bactérias potencialmente produtoras de exopolissacarídeos destacam-se as diazotróficas, sendo que os gêneros mais conhecidos são Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium (RIBEIRO; BURKERT, 2016).Esses biopolímeros são aplicados em diferentes setores, como indústrias alimentícias e farmacêuticas, e isso se deve ao fato de alterarem as propriedades físicas do meio onde se encontram, seja por conferirem alta viscosidade às soluções ou por criarem redes intermoleculares coesivas. São utilizados na indústria de alimentos como espessantes, estabilizantes, emulsificantes, coagulantes, gelificantes, entre outras aplicações (ARANDA- SELVERIO et al., 2010). A fonte de carbono é um dos fatores que influência a produção de EPS (RIBEIRO; TEIXEIRA; BURKERT, 2014), bem como o teor de nitrogênio e fósforo disponível, aeração, temperatura e pH da cultura (SERRATO, 2008). A viscosidade das soluções de EPS varia de acordo com pH, temperatura, concentração do EPS, massa molar e solubilidade (BARBOSA et al., 2004). Na produção de EPS por bactérias diazotróficas, é mencionado na literatura o uso de soro de queijo (ZHOU et al., 2014), água residual de indústria de pescados (SELLAMI et al., 2015) e glicerol residual (RIBEIRO, 2015). Neste trabalho, tem-se como objetivo avaliar a substituição do manitol por permeado de soro no cultivo de Mesorhizobium loti Semia816 , visando à produção de EPS, bem como a determinação da viscosidade em diferentes razões C/N.

Material e métodos

A bactéria foi reativada a 30ºC em meio YMA. Para o preparo do inóculo, a cultura microbiana foi raspada com 10 mL de água peptonada 0,1%, transferida para Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de caldo YMA. A suspensão foi incubada a 30ºC até atingir a DO 0,8 de acordo com Staudt, Wolf e Shrout (2012), sendo então transferidos 10 mL para o meio de cultivo. Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 90 mL de meio, inoculados com suspensão da bactéria a 30°C e 200 rpm. Foi utilizado o caldo YMA, pH 7,0, contendo manitol (C/N 96,5), fonte de carbono usual, e substituindo o manitol pelo permeado do soro na razão C/N 59,9 e também na razão de 96,5, através do ajuste da concentração do extrato de levedura, mantendo a concentração do permeado em 10 g/L. A biomassa foi monitorada por medida da absorbância a 600 nm no sedimento ressuspendido em água, centrifugada por 15 min a 10.000 x g (PRIETO et al., 2008). O pH do sobrenadante foi medido em medidor de pH (AOAC, 2000). A concentração de açúcar redutor foi determinada pelo método do ácido 3,5 ácido dinitrossalicílico (MILLER, 1959), com medida de absorbância a 540 nm e conversão para g/L a partir de uma curva padrão de lactose. O EPS foi recuperado ao final do cultivo, centrifugando-se 10 mL do caldo por 20 min a 10.000 x g, seguido de precipitação no sobrenadante por adição de etanol (1:3 v/v), centrifugação e quantificação por gravimetria, sendo que para determinação da viscosidade, após precipitação o EPS foi dissolvido, dialisado, liofilizado e solubilizado (1% m/v) em água Milli-Q, sendo determinada a viscosidade aparente (cP) em função da taxa de cisalhamento (s-1) utilizando um reômetro digital Brookfield (EUA).

Resultado e discussão

De acordo com a Figura 1 o cultivo em meio com permeado de soro (C/N 59,9) resultou em um maior crescimento, chegando a 0,72±0,04 g/L (96 h), seguido pelo cultivo em meio com manitol e com permeado na razão C/N 96,5, diferindo significativamente (p<0,05) entre si. Ao analisar a concentração de lactose presente em 96 h, na razão C/N 96,5 e 59,9, pode-se observar uma concentração de 5,37±0,09 e 3,79±0,25 g/L, respectivamente. Sendo assim, em uma menor relação C/N com maiores concentrações de nitrogênio, o crescimento do micro-organismo foi favorecido, implicando em um maior consumo do substrato. A concentração de EPS em meio com manitol foi de 1,57±0,14 g/L, diferindo significativamente (p<0,05) do meio com permeado na mesma razão C/N (1,12±0,04 g/L), mas não diferindo estatisticamente (p>0,05) do meio com permeado na razão C/N 59,9 (1,45±0,07 g/L), demonstrando que a bactéria foi capaz de assimilar o permeado tanto quanto assimila o manitol para produção de EPS. Já Ribeiro (2015) encontrou 6,44 g/L de EPS para esta mesma bactéria, utilizando glicerol residual (C/N 94), diferente dos resultados encontrados neste estudo, demonstrando que a fonte de carbono e razão C/N influenciam diretamente na produção do EPS. Ao analisar a viscosidade (Figura 2) verificou-se que as soluções de EPS apresentaram comportamento pseudoplástico típico, onde a viscosidade diminuiu com o aumento da taxa de cisalhamento. A solução preparada com o EPS produzido a partir do permeado (C/N 96,5) apresentou uma maior viscosidade inicial (15.142 cP), seguida pelo EPS obtido em meio com manitol (12.542 cP) e pelo EPS em meio com permeado (11.012 cP) na razão C/N 59,9. A razão C/N menor favoreceu a maior concentração do EPS. Por outro lado, a maior viscosidade foi encontrada em uma maior razão C/N.

* somente nos meios com permeado de soro

Conclusões

A bactéria foi capaz de crescer e produzir quantidades apreciáveis de EPS em meio contendo permeado. Para esta fonte de carbono, a diminuição da razão C/N de 96,5 para 59,9 influenciou positivamente a concentração do EPS, de 1,12±0,04 para 1,45±0,07 g/L, mas com efeito oposto na viscosidade de soluções a 1 % m.v. Todos os EPS apresentaram comportamento pseudoplástico. Pode-se concluir que a fonte de carbono e a concentração do nitrogênio influenciam diretamente na produção e nas propriedades reológicas do EPS, e a escolha da melhor razão C/N depende do destino dado ao EPS.

Agradecimentos

Os autores agradecem FAPERGS, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.

Referências

ARANDA-SELVERIO, G., PENNA, A. L. B., CAMPOS-SÁS, L. F., JUNIOR, O. S., VASCONCELOS, A. F. D., SILVA, M. L. C., LEMOS, E. G. M., CAMPANHARO, J. C., SILVEIRA, J. L. M. Propriedades reológicas e efeito da adição de sal na viscosidade de exopolissacarídeos produzidos por bactérias do gênero Rhizobium. Quimica Nova, v. 33, n. 4, p. 895-899, 2010

AOAC, Official Methods of Analysis (17thedn). Washington: Association of Official Analytical Chemists, 2000. CD-ROM.

BARBOSA, A. M., CUNHA, P. D. T., PIGATTO, M. M., SILVA, M. L. C. Produção e aplicações de exopolissacarídeos fúngicos. Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 25, n. 1, p. 29-42, jan./jun. 2004

JUNIOR, P. I. F., ALMEIDA, J. P. S., PASSOS, S. R., OLIVEIRA, P. J., RUMJANEK, N. G., XAVIER, G. R. Produção e comportamento reológico de exopolissacarídeos sintetizados por rizóbios isolados de guandu. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 45, n. 12, p. 1465-1471, dez. 2010.

MILLER, G.H. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v.31, p. 426-428, 1959.

PRIETO, L. M.; MICHELON, M.; BURKERT, J. F. M.; KALIL, S. J.; BURKERT, C. A. V. The production of rhamnolipid by a Pseudomonas aeruginosa strain isolated from a southern coast al zone in Brazil. Chemosphere, v. 71, p. 1781-1785, 2008.


RIBEIRO, V. A., TEIXEIRA, M., BURKERT, C. A. V. Cultivo de bactérias utilizando glicerina residual para obtenção de exopolissacarídeos. Congresso Brasileiro de Engenharia Química, XX, 2014. Florianópolis. 7p.

RIBEIRO, V. Produção e caracterização de exopolissacarídeos a partir de bactérias diazotróficas cultivadas em meios à base de glicerol residual. 2015. 192 f. Tese (Doutorado em Engenharia e Ciência de Alimentos).Universidade Federal do Rio Grande - FURG, Rio Grande, 2015.

RIBEIRO, V.A.; BURKERT, C. A. V. Exopolysaccharides produced by Rhizobium: Production, composition and rheological properties. Journal of Polymer and Biopolymer Physics Chemistry, v. 4, n. 1, p. 1-6, 2016.

SELLAMI, M.; OSZAKO, T.; MILED, N.; REBAH, F. B. Industrial waste water as raw material for exopolysaccharide production by Rhizobium leguminosarum. Brazilian Journal of Microbiology, v. 46, n. 2, p. 407-413, 2015.

SERRATO, R.V. Caracterização química e estrutural de exopolissacarídeos e lipopolissacarídeos produzidos por bactérias diazotróficasendofíticas. 2008. 143 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – UFPR, Curitiba. 2008.

STAUDT, A. K.; WOLFE, L. G., SHROUT, J. D. Variations in exopolysaccharide production by Rhizobium tropici. Archives of Microbiology, v. 194, p. 197–206, 2012.

ZHOU, F.; WU, Z.; CHEN, C.; CHEN, C.; HAN, J.; AI, L.; GUO, B. Exopolysaccharides produced by Rhizobium radiobacter S10 in whey and their rheological properties. Food Hydrocolloids, v. 36, p. 362-368, 2014.