Estudos conformacionais e de interação com membranas fosfolipídicas dos peptídeos HSP1 e [trz-G[sup]1[/sup]]HSP1 sintetizados quimicamente.

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Marinho, L.E.S. (UFVJM) ; Cardoso, G.A. (UFVJM) ; Guimarães, C.F.R.C. (UFMG) ; Santos, T.L. (UFVJM) ; Munhoz, V.H.O. (UFVJM) ; Resende, J.M. (UFMG) ; Magalhães, M.T.Q. (UFMG) ; Verly, R.M. (UFVJM)

Resumo

Modificações estruturais em peptídeos tem se mostrado uma excelente alternativa para potencializar seus espectros de atividade biológica. Uma das formas de modificações estruturais químicas em peptídeos é a síntese peptídica em fase sólida associada a outras reações, como a reação “click”, permitindo a obtenção de derivados triazólicos. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a síntese de um análogo triazole do peptídeo HSP1. Além disso, o trabalho apresenta estudos conformacionais e de interação do peptídeo HSP1 e do análogo [trz-G1]HSP1. Os dados obtidos nos experimentos de dicroísmo circular indicam um maior conteúdo helicoidal para [trz-G1]HSP1 e os experimentos de calorimetria de titulação isotérmica mostram maior interação do derivado triazólico em meios biomimético de POPC:POPG.

Palavras chaves

reação "click"; peptídeo antimicrobiano; triazole

Introdução

O uso de azóis para o combate a doenças causadas por fungos ocorreu com a introdução de dois medicamentos, o miconazole e o clotrimazole, no final dos anos 60 (Sheehan et al., 1999). Azóis são heterocíclicos de cinco membros contento um ou mais átomos de nitrogênio (Melo et al., 2006). Entre os azóis, uma importante classe que merece destaque são os triazóis. Os triazóis possuem aplicação farmacológica diversificada, desde o tratamento de doenças superficiais até infecções sistemáticas (Sheehan et al., 1999). Apesar do uso amplo e eficiente desses fármacos, estudos demostraram o desenvolvimento de resistência de fungos, como Candida albicans e Paracoccidioidomicose brasiliensis (Casalinuovo et al., 2004). No entanto, o uso de triazóis ainda é atrativo devido à capacidade de conectar dois fármacos e produzir moléculas biofuncionais (Petrova et al., 2015). A classe dos peptídeos antimicrobianos têm se mostrado uma eficiente alternativa à substituição de antibióticos, devido a sua ampla atividade antibacteriana e baixa toxicidade farmacológica (Ferreira et al., 2015). O peptídeo HSP1, isolado do anuro Hyla punctata e constituído por 14 resíduos de aminoácido (GILDAIKAIAKAAG), possui moderada atividade antimicrobiana e baixa citotoxicidade (Prates et al., 2004). Ainda assim, estudos recentes demonstraram que alterações estruturais nesse peptídeo, como a inserção de anéis sacarídeos, foram capazes de elevar consideravelmente a atividade antifúngica frente a culturas do gênero Candida (Junior et al., 2017). No presente trabalho, o peptídeo HSP1 e o seu análogo [trz-G1]HSP1 foram sintetizados e empregados para estudos biofísicos em meios biomiméticos para avaliação das alterações conformacionais e de interação peptídeo-membrana causados pela presença do anel triazólico.

Material e métodos

A síntese do peptídeo foi realizada em fase sólida (SPFS), via estratégia 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) (Chan e White, 2000). Após a síntese, o anel triazol foi inserido por meio da reação “click”, onde há a cicloadição [2+4] entre um grupo azida e um grupo alcino (Melo et al., 2006). Na síntese do peptídeo [trz-G1]HSP1, primeiramente o resíduo de Gly-1 foi substituído por propargilglicina ([Pra1]HSP1) na SPFS. Em seguida, foi realizada a reação de cicloadição entre o alcino terminal do resíduo de Pra-1 com azida de sódio em presença de sulfato de cobre(II) pentahidratado (CuSO4.5H2O) e ascorbato de sódio como agente redutor (Rostovtsev et al., 2002; Freitas et al., 2011). Os peptídeos HSP1 e [trz-G1]HSP1, foram caracterizados por espectrometria de massa (MALDI-ToF) e purificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa. Os estudos conformacionais foram realizados por meio da espectroscopia de dicroísmo circular (CD) empregando-se 100 µM de HSP1 e de [trz-G1]HSP1 na presença de diferentes concentrações de soluções vesiculares (LUVs) de POPC:POPG (3:1) em tampão Tris-HCl (20 mM) pH 8,5 contendo 100 mM de NaCl. Os estudos termodinâmicos foram realizados em um microcalorímetro VP-ITC da Malvern® a 25 ºC. Esses experimentos foram realizados empregando-se 200 µM de HSP1 e 25 µM de [trz-G1]HSP1 na presença de 10 mM de POPC:POPG (3:1). Cada experimento consistiu de 50 injeções sucessivas de POPC:POPG (3:1), sendo a primeira de 1 µL e as demais de 5 µL.

Resultado e discussão

As massas teóricas calculadas para os peptídeos HSP1 e [trz-G1]HSP1 foram 1310,6 Da e 1390,5 Da, respectivamente. De acordo com os ionogramas obtidos, a presença de íons m/z 1311,6 e 1391,5 [M+H]+ comprovam a eficiência da síntese dos peptídeos HSP1 e [trz-G1]HSP1 (Figura 1). Considerando que a atividade antimicrobiana de grande parte dos PAMs está associada a conformação que adquirem ao interagir com seus alvos (Voievoda et al., 2015; Kosikowska e Lesner, 2016), foram realizados experimentos de CD para avaliar a conformação adotada na presença das LUVs de POPC:POPG. Os espectros obtidos de CD apresentam dois vales negativos entre 200 e 230 nm, indicativo de uma conformação helicoidal (Cantor e Timasheff, 1982). No entanto, verifica-se um maior conteúdo de hélice para o derivado [trz-G1]HSP1 quando comparado ao peptídeo HSP1 (Cantor e Timasheff, 1982). A interação dos peptídeos com as LUVs de POPC:POPG foi estudada por ITC. Os resultados revelam que o peptídeo HSP1 apresenta interação fraca com a LUVs, uma vez que o fluxo de calor da titulação de LUVs em solução de HSP1 foi semelhante ao da isoterma de diluição das vesículas (LUV) (Figura 2A). Por outro lado, a titulação de LUVs em solução de [trz-G1]HSP1 verifica-se que o aumento da razão molar LUVs/peptídeo resulta na diminuição do fluxo de calor, até valores tornam-se constantes (Figura 2B). Essa diferença mostra que a interação peptídeo-membrana é maior para o derivado triazólico com as vesículas aniônica. Tal comportamento está em acordo com os dados de CD que revelaram a maior helicidade para o derivado triazólico em comparação com o peptídeo HSP1.

Conclusões

Os resultados demonstraram que a inserção do anel triazol altera as propriedades do peptídeo HSP1. Além de aumentar o ganho estrutural, o análogo [trz-G1]HSP1 apresentou uma interação maior com as vesículas de POPC:POPG. Esse dado pode estar relacionado com o aumento da atividade antifúngica deste análogo. Outros estudos serão feitos com este análogo, a fim de compreender melhor o aumento da atividade em comparação com o HSP1.

Agradecimentos

CAPES, EMBRAPA, CNPq, RQMG, UFVJM.

Referências

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