Bioprodução de Carotenoides: Estratégias de Cultivo em Batelada Alimentada Utilizando Glicerol Bruto

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Ores, J.C. (FURG) ; Souza, I.L.R. (FURG) ; Pereira, R.N. (FURG) ; Burkert, C.A.V. (FURG)

Resumo

Devido às propriedades biológicas benéficas dos carotenoides microbianos, os mesmos vêm atraindo interesse da indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética. Assim, o presente trabalho propõe a produção de carotenoides por batelada alimentada pela levedura oleaginosa Rhodotorula mucilaginosa utilizando glicerol bruto. Diferentes estratégias foram estudadas, variando a composição e quantidade dos pulsos, totalizando seis ensaios. Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyer, 180 rpm, 25 °C. A batelada com dois pulsos de meio de cultivo (contendo glicerol bruto) em 96 h e 192 h proporcionou um aumento na produção de carotenoides de 48,8%, alcançando uma produtividade de 4,2 µg/L.h, demonstrando o potencial desta levedura como fonte para obtenção de carotenoides microbianos.

Palavras chaves

batelada alimentada; glicerol bruto; carotenoides

Introdução

Com o aumento da produção nacional e mundial do biodiesel, há vários estudos sobre o reaproveitamento do glicerol bruto, como a utilização de micro-organismos oleaginosos para a produção de lipídios e carotenoides (CHATZIFRAGKOU et al., 2011; MACHADO; BURKERT, 2015; SPIER, 2014). O glicerol, ou 1-2-3-propanotriol, é um álcool tri-hidroxilado gerado na produção do biodiesel, sendo que 100 lbs de biodiesel produzidos por transesterificação de óleos vegetais ou animais resultam em 10 lbs de glicerol bruto (KNOTHE et al., 2006; LORA; VENTURINI, 2012). As leveduras oleaginosas são aquelas capazes de acumular lipídios acima de 20% de sua biomassa em base seca, como as pertencentes aos gêneros Yarrowia, Rhodotorula, Cryptococcus, entre outros (LI; DU; LIU, 2008; MENG et al., 2009; PAN et al., 2009). A levedura oleaginosa Rhodotorula mucilaginosa foi isolada pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Engenharia de Bioprocessos da FURG (OTERO, 2011). Trabalhos anteriores demonstraram seu elevado potencial para sintetizar carotenoides (CIPOLATTI, 2012; OTERO, 2011) e, também, sua capacidade em utilizar glicerol bruto oriundo da produção de biodiesel como fonte de carbono (SPIER, 2014). Os carotenoides são corantes naturais amplamente utilizados nas indústrias alimentícia, farmacêutica, de cosméticos e ração animal, principalmente devido às suas propriedades biológicas, como atividade antioxidante, pró vitamínica A, entre outras (VALDUGA et al., 2009). O aumento da consciência dos consumidores pela saúde e alimentos funcionais vem desencadeando um aumento na demanda por carotenoides pela indústria alimentícia. Apesar da crescente procura pelos pigmentos obtidos de fontes microbianas, estes ainda possuem um elevado custo de produção do que os obtidos de fonte sintética (VENIL; ZAKARIA; AHMAD, 2013). Uma forma de reduzir estes altos custos seria o emprego de substratos alternativos e mais econômicos no cultivo destes micro-organismos, como é o caso do glicerol. Outra forma seria o pleno uso dos subprodutos resultantes do cultivo. A biomassa residual resultante do processo de extração dos lipídios poderia ser utilizada para alimentação animal, pois, contêm quantidades significativas de proteínas, carboidratos e outros nutrientes. Ou ainda, poderia ser destinada para produção de metano por digestão anaeróbia, o que tornaria o preço final mais favorável e competitivo (MENG et al., 2009). A produção biotecnológica também vem se destacando devido à comprovada atividade biológica destas biomoléculas (CIPOLATTI et al., 2015). Além disso, o cultivo de leveduras possui algumas vantagens como: rapidez de geração (leveduras têm tempo de geração entre 1-3 horas); menor área de produção (comparado à fonte vegetal); não está sujeito a variações climáticas ou mesmo pragas; melhor controle de produção e do produto, ente outras (AQUARONE et al., 2001). Neste cenário, a produção de carotenoides oriundos de fontes microbianas apresenta-se como uma alternativa importante na substituição dos pigmentos sintéticos. O gênero Rhodotorula é conhecido por sua capacidade de biossintetizar os carotenoides β-caroteno, toruleno e torularrodina, em diferentes proporções (COSTA et al., 1987; KAISER et al., 2007; OTERO, 2011). Para a produção microbiana de carotenoides em escala laboratorial tem sido estudados processos em batelada (CARDOSO et al., 2016; FREITAS et al., 2014; MACHADO; BURKERT, 2015), batelada alimentada (DIAS et al., 2015; GARCÍA CAÑEDO et al., 2016; LUNA-FLORES et al., 2010), contínuo (GHARIBZAHEDI; RAZAVI; MOUSAVI, 2014; ZHU; JIANG, 2008) e semi-contínuo (FUENTES-GRÜNEWALD et al., 2015). Estes diferentes modos de alimentação impactam no acúmulo do bioproduto de interesse ao final do processo. A diferença de cada modo de cultivo é a forma como se alimenta o biorreator com o meio. No descontínuo, ou batelada, o meio é adicionado somente no início do processo. Em batelada-alimentada, operações intermitentes de entrada do meio e saída de material fermentado são realizadas de forma repetida. Já no processo contínuo, essa alimentação é constante, assim como a saída de caldo fermentado (REGULY, 2000). A vantagem do processo em batelada alimentada é que a concentração do nutriente limitante pode ser mantida a níveis mais baixos, evitando a repressão que o mesmo pode ocasionar ao sistema. Além disso, permite um controle sobre a taxa de crescimento dos micro-organismos, uma vez que está relacionada com a taxa específica de captação de oxigênio, garantindo um maior controle sobre a demanda de oxigênio (STANBURY; WHITAKER; HALL, 1995). O objetivo deste trabalho foi estudar diferentes estratégias de batelada alimentada para a obtenção de carotenoides pela levedura Rhodotorula mucilaginosa, utilizando como fonte de carbono o glicerol bruto, coproduto da síntese de biodiesel.

Material e métodos

Neste trabalho foi utilizada a levedura Rhodotorula mucilaginosa, previamente isolada pelo grupo de trabalho e depositada na Fundação André Tosello (n°7688). A levedura foi mantida em ágar inclinado YM composto por (g/L): glicose (10), peptona (5), extrato de malte (3), extrato de levedura (3), ágar bacteriológico (20). Para o inóculo, a cultura foi raspada com água peptonada 0,1% e transferida para um Erlenmeyer contendo 180 mL de caldo YM, incubado 30 °C e 180 rpm (SPIER, 2014). Os cultivos em batelada alimentada para a produção de carotenoides foram realizados em frascos Erlenmeyer (500 mL) com volume inicial de meio de cultivo de 200 mL composto por (g/L): glicerol bruto (30), fosfato de potássio monobásico (5), fosfato dissódico (1), sulfato de magnésio heptahidratado (3), extrato de levedura (1,2), pH inicial 4,5, 25 °C, 180 rpm, 20%v/v de inóculo e concentração inicial de 10⁷ células/mL (SPIER, 2014). Seis estratégias de batelada alimentada foram estudadas: (1) e (2): pulso de 20 mL (correspondente a 10%v/v do volume inicial do cultivo) de meio de cultivo (contendo glicerol bruto) ou glicerol bruto na fase exponencial de crescimento (48 h); (3) e (4): pulso de 20 mL de meio de cultivo ou glicerol bruto na fase estacionária (144 h); (5): dois pulsos de 20 mL de meio de cultivo (96 h e 192 h); (6): 20 mL de meio de cultivo (96 h) + 20 mL de glicerol bruto (192 h). Os pulsos de meio de cultivo e/ou glicerol bruto foram preparados em uma concentração 10 vezes maior que a do meio inicial. Durante cada cultivo, alíquotas foram retiradas para as determinações de pH, biomassa e carotenoides. Para cada condição foi calculado, também, a velocidade específica máxima de crescimento (1/h) e a produtividade em carotenoides (µg/L.h). A biomassa foi determinada por leitura da absorvância em 600 nm e conversão em massa seca (g/L) através de uma curva padrão (CHOI; PARK, 2003) e o pH por leitura em medidor de pH (AOAC, 2000). A determinação dos carotenoides totais (CT) foi realizada conforme a metodologia de Fonseca et al. (2011) modificada por Cipolatti et al. (2015). Em 0,05 g de biomassa seca (35 °C/48 h), moída, peneirada (Tyler 115) e congelada (-18 °C/48 h) foi adicionado 2 mL de dimetilsulfóxido (55 °C). A suspensão foi agitada por 1 min com intervalos de 15 min, totalizando 1 h. Após, foram adicionados 6 mL de acetona e a amostra foi centrifugada (1745×g, 10 min) para separação do solvente. O procedimento foi repetido até o branqueamento da célula. No solvente foram adicionados 10 mL de NaCl 20%m/v e 10 mL de éter de petróleo. Após agitação e separação das fases, o excesso de água foi retirado com sulfato de sódio (MICHELON et al., 2012). Os CT nos extratos foram determinados por leitura da absorvância em 448 nm (MACHADO; BURKERT, 2015) e calculados conforme Davies (1976). Todos os cultivos foram realizados em triplicata e os resultados foram tratados por análise de variância e teste de Tukey (p<0,05).

Resultado e discussão

As Figuras 1 e 2 apresentam os resultados de produção de carotenoides e a produtividade (em termos de carotenoides) obtidos ao final de cada uma das estratégias de batelada alimentada avaliadas no cultivo da levedura Rhodotorula mucilaginosa, ou seja, nos valores máximos de biomassa obtidos em cada cultivo. Também foi realizado um ensaio controle sem a realização de pulso de nutrientes (batelada simples). A realização de pulsos de apenas glicerol bruto, tanto na fase exponencial (48 h) como na fase estacionária de crescimento (144 h e 192 h) da levedura em estudo ocasionou uma diminuição na produção de biomassa e de carotenoides, comparado ao ensaio sem pulso de nutrientes. Na produção de carotenoides esta queda foi de 36,8% para o pulso em 48 h e 48,2% para o pulso em 144 h. Na produção de biomassa a queda foi de 35,7% para o em 48 h e 46,4% para o pulso em 144 h. A produtividade de carotenoides passou de 4 g/L.h para 3 g/L.h (pulso em 48 h) e 2,1 g/L.h (pulso em 144 h). Este comportamento sugere um possível efeito inibitório causado pelo excesso de carbono no meio, que é a principal fonte de energia da levedura. O pulso de meio de cultivo (que contém glicerol bruto em sua composição) em 48 h, durante a fase exponencial de crescimento, também não favoreceu a produção de carotenoides, com uma queda de 31,6%, porém, o mesmo não influenciou o crescimento da levedura. A produção final de biomassa foi de 9 g/L no cultivo com o pulso de meio em 48 h, valor estatisticamente igual ao obtido na batelada simples (8,4 g/L). Já o pulso de meio de cultivo durante a fase estacionária de crescimento (144 h) ocasionou um aumento de 44,7% no crescimento da levedura e de 27,8% na produção de carotenoides, comparado ao ensaio em batelada simples. Sendo assim, foi necessária a adição de outros nutrientes além da fonte de carbono (glicerol) – como extrato de levedura (fonte de nitrogênio) e sais – para induzir uma maior produção de biomassa e de carotenoides durante a fase estacionária (onde o micro-organismo está desacelerando o seu metabolismo) sem causar um efeito inibitório. O cultivo com pulso de meio em 96 h (final da fase exponencial e início da fase estacionária) seguido de um pulso de glicerol em 192 h ocasionou um aumento na biomassa de 29,4% e um decréscimo no conteúdo de carotenoides de 42,3%, comparado ao ensaio sem pulsos. No cultivo onde foram realizados dois pulsos de meio, o primeiro em 96 h e o segundo em 192 h, ocorreu um aumento de 18,8% e 48,8% na produção de carotenoides e biomassa, respectivamente. Novamente o pulso de apenas glicerol no meio acabou inibindo a produção de carotenoides, mesmo após a adição de outros nutrientes no pulso de 96 h. Na literatura são encontrados poucos estudos de batelada alimentada para a produção carotenoides. No cultivo de Luna-Flores et al. (2010) da levedura Xanthophyllomyces dendrorhous (também conhecida como Phaffia rhodozyma), a estratégia da batelada alimentada aumentou a produção de carotenoides em 30,8%. No estudo de Buzzini (2001), houve um aumento de 32,5% na produção de carotenoides no cultivo em batelada alimentada da levedura Rhodotorula glutinis. Ambos os valores foram inferiores ao máximo obtido neste trabalho, que foi de 48,8% (2 pulsos de meio de cultivo contendo glicerol em sua composição). A adição de 120 mg de glicerol, juntamente com os demais nutrientes do meio, induzem uma maior produção deste pigmento pela levedura Rhodotorula mucilaginosa, demonstrando a potencialidade desta levedura para obtenção de carotenoides. Diversos estudos têm sido realizados utilizando o glicerol bruto como fonte de carbono no meio de cultivo para a produção de carotenoides. No estudo de Kot et al. (2017) a suplementação do meio de cultura com 5%m/v de glicerol bruto resultou em uma produção de carotenoides entre 1,5 e 3,5 mg/L pela levedura Rhodotorula glutinis, dependendo do pH do meio utilizado. O cultivo da levedura Phaffia rhodozyma com glicerol bruto e o efluente água de parboilização de arroz, realizado por (SILVA et al., 2016), resultou em uma produção máxima de carotenoides de 4,1 μg/mL. No trabalho de Cardoso et al. (2016), a substituição do glicerol puro pelo glicerol bruto aumentou a concentração de carotenoides em 21,4% no cultivo da levedura Sporobolomyces ruberrimus. Lee et al. (2014) obtiveram uma produção de carotenoides entre 18 e 28,5 mg/L utilizando 60 g/L de glicerol no meio de cultivo para três diferentes cepas da levedura Rhodosporidium toruloides. Já no cultivo da levedura Sporidiobolus pararoseus com meio de cultivo contendo glicerol bruto e água de maceração de milho, Machado e Burkert (2015) alcançaram uma produção de carotenoides totais de 520,94 µg/L. Com relação aos valores de velocidade específica máxima de crescimento (µ_max), os maiores resultados foram obtidos nas estratégias onde foram realizados pulsos na fase exponencial de crescimento da levedura (glicerol 48 h, meio de cultivo 48 h) e nas estratégias com dois pulsos (glicerol+meio, meio+meio), sendo que estes foram estatisticamente iguais entre si e variaram entre 0,064 e 0,067 1/h. O cultivo sem pulso de nutrientes (controle) alcançou o menor valor de µ_max, que foi de 0,047 1/h.

Letras diferentes indicam diferença significativa entre as médias (p<0,05).


Letras diferentes indicam diferença significativa entre as médias (p<0,05).

Conclusões

A estratégia de cultivo em batelada alimentada demonstrou ser eficiente para a produção de carotenoides microbianos. Pulsos de meio de cultivo contendo glicerol bruto como fonte de carbono em 96 h e 192 h de crescimento proporcionaram um aumento na produção de carotenoides de 48,8%, alcançando uma produtividade de 4,2 µg/L.h e uma produção de biomassa de 16,4 g/L. Os pulsos contendo apenas glicerol bruto durante o cultivo causaram um efeito inibitório no crescimento da levedura e na produção de carotenoides. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram o potencial da levedura oleaginosa Rhodotorula mucilaginosa como fonte para obtenção de carotenoides microbianos, necessitando ainda de estudos de aumento de escala.

Agradecimentos

À CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro e concessão de bolsas.

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