ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO HILASEPTINA P2 EM MEIO BIOMIMÉTICO

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Nunes, L.O. (UFVJM) ; Magalhães Resende, J. (UFMG) ; Torquato Quezado de Magalhães, M. (UFMG) ; Lopes Santos, T. (UFVJM) ; de Oliveira Munhoz, V.H. (UFVJM) ; Moreira Verly, R. (UFVJM)

Resumo

Peptídeos são biomoléculas que na sua grande maioria apresentam alguma atividade biológica. Essa atividade é bastante ampla, passa pela fisiologia animal e humana (HOFFMANN; FOSGERAU, 2015) e inclui ações contra microrganismos, com destaque aqui para os peptídeos antimicrobianos (ZASLOFF, 2002). O mecanismo de ação desses peptídeos ainda não foi totalmente elucidado e está relacionado ao modo de interação dos peptídeos com a membrana fosfolipídica. Assim, este trabalho apresenta o estudo estrutural do peptídeo antimicrobiano Hilaseptina P2 por ressonância magnética nuclear em presença de micelas de dodecilfosfocolina. Os resultados mostram que o peptídeo adquire uma conformação anfipática em α- hélice que se estende do resíduo 2 ao 24 e que permite melhor interação com o meio empregado.

Palavras chaves

peptídeos antimicrobianos; interação peptídeo-membra; Hilaseptina P2

Introdução

A atividade biológica de grande parte dos peptídeos antimicrobianos está fortemente relacionada à estrutura secundária que o peptídeo adota ao interagir com a membrana do microrganismo. Assim sendo, é fundamental entender o modo de interação de peptídeos com membranas biomiméticas (WIMLEY, 2010). Nesse contexto, a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) surge como uma importante ferramenta por meio da qual é possível elucidar a estrutura secundária que peptídeos adotam quando interagem com membranas biomiméticas (RAMAMOORTHY, 2009). As técnicas bidimensionais como espectroscopia de correlação total (TOCSY), espectroscopia de efeito nuclear Overhauser (NOESY), coerência heteronuclear de simples quantum (13C-1H HSQC) e coerência heteronuclear de múltiplos quanta (15N-1H HMQC) destacam-se quando se trata de determinação de estrutura tridimensional de peptídeos (WUTRICH, 1991). O peptídeo antimicrobiano Hilaseptina P2, isolado do anuro Hypsiboas punctatus, apresenta considerável atividade biológica contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (MUNHOZ, 2012). Esse peptídeo é composto por 25 resíduos de aminoácidos (GIGDILKNLAKAAGKAALHAVGESL) e sua estrutura primária apresenta homologia com a estrutura de outros peptídeos extraídos de anuros como a Dermadistinctina k (VERLY et al., 2009) e as Fenilseptinas (MUNHOZ, 2012), os quais interagem fortemente com membranas biomiméticas. Nesse sentido, o presente trabalho propõe a síntese, caracterização e purificação do peptídeo Hilaseptina P2 (HSP2) para estudos da relação estrutura-atividade do peptídeo em meio biomimético formado por micelas de dodecilfosfocolina (DPC-d38). Foram realizados experimentos de RMN bidimensionais em DPC-d38 para elucidação estrutural do peptídeo.

Material e métodos

O peptídeo HSP2 foi obtido por meio da síntese em fase sólida, via estratégia fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) (CHAN; WHITE, 2000). Os derivados de aminoácidos utilizados na síntese foram adquiridos da Sigma- Aldrich contendo grupo amino protegido por grupamento Fmoc e a cadeia lateral, se reativa, protegida por t-butiloxicarbonila (Boc) ou trifenilmetila (trt) ou t-butila (tBu). Após a síntese, foi feita a purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa empregando-se coluna Vydac® C18 (250 × 4,6 mm) e loop de 100 µL. A caracterização foi realizada por espectrometria de massa (MALDI-ToF) em equipamento Bruker AutoFlex III. O ionograma foi obtido em espectrômetro de massa operando em modo positivo com faixa de massa entre 800 a 5000 Da. Para a realização dos experimentos de RMN, uma solução aquosa do peptídeo (2 mM) foi dispersa em solução de DPCd38 (200 mM) contendo 10 % v/v de D2O. Foram feitos experimentos 2D de espectroscopia de Correlação Total (TOCSY), espectroscopia de Efeito Nuclear Overhouser (NOESY), Coerência Heteronuclear de Simples Quantum (13C-1H HSQC) e Coerência Heteronuclear de Múltiplos Quanta (15N-1H HMQC). Os experimentos foram realizados utilizando-se um espectrômetro de RMN Bruker AVANCE III 600. Os mapas de contorno foram interpretados com auxílio do programa NMRVIEW® versão 5.0.4 (JOHNSON; BLEVINS, 1994) e os cálculos de dinâmica molecular foram realizados utilizando-se o software Xplor-NIH (SCHWIETERS et al., 2006). As estruturas tridimensionais foram analisadas no software MOLMOL (KORADI et al., 1996). Através da plataforma on-line Protein Structure Validation Software Suite (PSVS, 2017) foi gerado o diagrama de Ramachandran para avaliação da qualidade das estruturas obtidas.

Resultado e discussão

Após a análise de todos os mapas de contornos, realizou-se a atribuição completa dos núcleos de 1H, 13C e 15N do HSP2. As correlações inter- residuais e intrarresiduais obtidas no mapa de contorno NOESY foram convertidas em restrições de distância, levando-se em conta suas intensidades. O resumo dessas correlações é demonstrado na figura 1 anexa. Já as restrições de ângulo diedro foram determinadas a partir dos deslocamentos químicos dos nitrogênios amídicos, dos hidrogênios (Hα e Hβ) e dos carbonos Cα e Cβ. Os dados de restrição de distância em conjunto com os de ângulos foram utilizados no cálculo de dinâmica molecular para obtenção de 100 estruturas tridimensionais, das quais as 10 de menor energia foram selecionadas. A sobreposição dessas 10 estruturas revelou alta convergência entre elas, com RMSD de 0,5 para a região helicoidal (I-2 a E-24) (KUFAREVA; ABAGYAN, 2012). A figura 2, anexa, mostra a estrutura menos energética obtida após o cálculo. A estrutura revela que o HSP2 apresenta uma conformação em α-hélice na presença de DPCd38 (HUANG et al., 2010). Além disso, as estruturas calculadas apresentam elevada anfipaticidade do resíduo de aminoácido I-2 até o V-21 (TOSSI et al., 2000).

Diagrama de NOE´s obtidos no mapa de contorno NOESY.


Estrutura menos energética obtida após o cálculo das estruturas.

Conclusões

O peptídeo HSP2 foi sintetizado e caracterizado para os estudos de RMN na presença de DPCd38. A análise dos mapas de contorno de RMN possibilitou a obtenção de estruturas tridimensionais do peptídeo. Os resultados demostraram que o HSP2 apresenta uma conformação helicoidal predominantemente anfipática em presença de micelas de DPCd38.

Agradecimentos

CAPES, CNPQ, FAPEMIG e Rede Mineira de Química.

Referências

CHAN, W. C.; P. D. WHITE. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Oxford, Oxford University Press. 2000. 346 p.

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