ESTUDO DE BIOMARCADORES NITROGENADOS DA INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔNICA: CREATININA, UREIA E AMÔNIA

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Genuncio Silva, L. (UENF) ; Gomes da Silva, M. (UENF) ; Pessanha de Castro, M.P. (UENF) ; Mansur Kuba, V. (FMC) ; Martins Santiago Neto, R. (PRORIM) ; Espécie Bueno, S.C. (UENF) ; Silva Sthel, M. (UENF) ; Mota, L. (UENF)

Resumo

Biomarcadores nitrogenados como creatinina, ureia e amônia podem indicar Insuficiência Renal Crônica (IRC) dependendo da concentração no sangue ou respiração. O objetivo geral deste trabalho foi analisar os biomarcadores da IRC, creatinina, ureia e amônia para quatro voluntários. Foram calculados o Clearance de creatinina por meio da equação de Cockcroft-Gault, e também detectou-se amônia na respiração dos voluntários aplicando a Espectroscopia Fotoacústica Gasosa. Os dois voluntários doentes exalaram maiores concentrações de amônia, exibindo níveis superiores de ureia e creatinina sanguíneas, e menores valores de Clearance quando comparados aos dois voluntários saudáveis. A pesquisa poderá contribuir com futuros diagnósticos não-invasivos da IRC por meio da detecção de amônia no hálito.

Palavras chaves

Biomarcadores; Insuficiência Renal; Fotoacústica

Introdução

A Insuficiência Renal Crônica (IRC) pode ser definida como uma doença na qual os rins deixam de filtrar adequadamente o sangue para eliminação de impurezas do corpo (BORTOLOTT, 2008). Alguns compostos químicos nitrogenados como a creatinina (C₄H₇N₃O), ureia (CH₄N₂O) e amônia (NH₃) podem indicar a doença dependendo de sua concentração no sangue ou na respiração, por este motivo são considerados biomarcadores (NARASIMHAN et al., 2001). O nível normal de ureia sanguínea é de 10 a 50 mg/dL. Contudo, o parâmetro mais confiável e amplamente utilizado pela comunidade médica para diagnóstico da IRC é a Taxa de Filtração Glomerular (TFG) estimada pelo cálculo do Clearance de creatinina (Cc), que determina quantos mL de sangue os rins filtram por minuto diariamente (ABENSUR, 2011; SODRÉ et al., 2007). A creatinina é uma proteína oriunda do metabolismo da creatina muscular, produzida constantemente durante o dia e filtrada livremente pelos rins. Desta maneira, o cálculo do Cc deve levar em consideração aspectos pertinentes musculatura do indivíduo como idade (anos), peso (kg) e sexo (masculino ou feminino). O nível de creatinina considerado normal no sangue é de 0,6 a 1,4 mg/dL (ABENSUR, 2011; BURMEISTER et al., 2007; NAPOLI FILHO et al., 2008). A Sociedade Internacional de Nefrologia define a IRC a partir do valor do Cc: Cc ≥ 90 mL/min desde que haja lesão renal por um período ≥ 3 meses; ou Cc < 60 mL/min com ou sem lesão renal por período ≥ 3 mêses. Sendo a função renal considerada normal desde que 90 mL/min ≤ Cc ≤ 120 mL/min sem lesão renal crônica (BASTOS et al., 2004, 2009, 2010; INTERNATIONAL SOCIETY OF NEPHROLOGY, 2013). Outro biomarcador nitrogenado bem estabelecido para IRC é a amônia. A produção de amônia pelo organismo está relacionada ao metabolismo de proteínas ingeridas na alimentação. Entretanto, como a amônia é tóxica torna-se necessário eliminá-la. Uma pequena quantidade deste composto é expelida na respiração devido às trocas gasosas entre o sangue e o ar alveolar. Sendo que o principal mecanismo de excreção é através da urina após a amônia ser convertida em ureia no ciclo da ureia hepática (BUSZEWSKI et al., 2007; RISBY; TITTEL, 2010; WOJTAS et al., 2012; WOJTAS et al., 2014; WANG; SAHAY, 2009; KIM; JAHAN; KABIR, 2012; WANG et al., 2012; LOURENÇO; TURNER, 2014). Na respiração de indivíduos saudáveis a amônia é usualmente detectável em torno de 0,25 ppmv (partes por milhão em volume). Já em indivíduos com IRC esta concentração tende a aumentar, uma vez que os rins diminuem significativamente a função de filtrar o sangue para eliminação da ureia, o que promove um desequilíbrio no ciclo da ureia hepática levando ao excesso de amônia no corpo (NARASIMHAN et al., 2001; MCCURDY et al., 2007; WANG; SAHAY, 2009; POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011b; NAVAS; JIMÉNEZ; ASUERO, 2012; TITTEL et al., 2012; WANG et al., 2012). Um método inovador que vem sendo estudado para diagnóstico e monitoramento da IRC é a detecção de amônia como biomarcador no hálito humano por meio da aplicação da Espectroscopia Fotoacústica Gasosa acoplada ao LASER de Cascata Quântica (EFG-QCL) (DUMITRAS et al., 2005; BAPTISTA FILHO et al., 2006; KOSTEREV et al., 2008; RISBY; TITTEL, 2010; TITTEL, 2012). Este método é vantajoso por possibilitar medições não invasivas, uma vez que basta coletar e medir a respiração do paciente. Ademais, a EFG-QCL apresenta baixo custo instrumental, elevada sensibilidade, seletividade e baixos limites de detecção (ppmv e ppbv) (MIKLÓS; HESS; BOZÓKI, 2001; SIGRIST, 2003). Sabe-se que no Brasil cerca de 10 milhões de pessoas apresentam IRC, e 113 mil necessitam de terapia renal substitutiva como sessões de hemodiálise (SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA, 2015; SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA, 2016). Sendo assim, justifica-se a importância de realizar pesquisas que visem quantificar amônia a nível de traço na respiração humana, uma vez que a comunidade médica pode futuramente utilizar este tipo de aplicação para auxiliar no diagnóstico precoce e estabelecer monitoramentos não invasivos da IRC. Tendo em vista este cenário, o objetivo geral desta pesquisa foi analisar os biomarcadores da IRC, ureia, creatinina e amônia para dois voluntários saudáveis (VS1 e VS2), e dois voluntários doentes (VIRC1 e VIRC2). Os objetivos específicos foram calcular o Cc utilizando a equação de Cockcroft-Gault e detectar amônia na respiração humana por meio da aplicação da EFG-QCL.

Material e métodos

Quatro voluntários participaram da pesquisa, dois saudáveis (VS1 a VS2) e dois doentes (VIRC1 e VIRC2). Solicitou-se aos mesmos que disponibilizassem um exame de sangue recente, realizado durante o período de desenvolvimento da pesquisa, a fim de que os níveis de ureia e creatinina fossem investigados. Também foi realizada uma entrevista a fim de coletar dados para o cálculo do Cc. Os valores de Cc (mL/min) foram calculados conforme a equação de Cockcroft-Gault: y = (140 – idade) x peso ÷ creatinina x 72. Sendo assim, Cc = y x 1,00 (para homens) ou Cc = y x 0,85 (para mulheres). Então, foi possível confirmar a classificação dos voluntários como saudáveis ou não, e determinar o estágio da IRC em que se encontravam (BASTOS et al., 2004, 2009, 2010; BURMEISTER et al., 2007; SODRÉ et al., 2007; NAPOLI FILHO et al., 2008). A fim de verificar se a concentração de amônia na respiração dos voluntários doentes seria maior do que nos voluntários saudáveis empregou-se a EFG-QCL, que se baseia no princípio físico de transformação de energia luminosa em energia térmica para geração de energia acústica, que é convertida no detector em um sinal elétrico denominado sinal fotoacústico diretamente proporcional a concentração da molécula de interesse (MIKLÓS; HESS; BOZÓKI, 2001; SIGRIST, 2003; BAPTISTA FILHO et al., 2006). O QCL adotado é caracterizado por ser uma fonte de radiação seletiva, uma vez que emite no infravermelho médio em torno de 1046,40 cm^-1, região de absorção da amônia. Os parâmetros do QCL foram potência de 1,060 mW, duração de pulso de 30 ns e taxa de repetição de 1,5 μs. A frequência de ressonância do detector foi de 3779,5 Hz e constante de tempo de 300 ms (BAPTISTA FILHO et al., 2006). Empregou-se no experimento filtro de KOH e filtro físico de N₂ líquido para eliminação respectivamente de CO₂ e vapor de H₂O das amostras. Realizou-se uma curva de calibração fotoacústica de amônia com a finalidade de determinar o limite de detecção do sistema. Para isso utilizou-se um cilindro de 10 ppmv de amônia certificada (White Martins) diluída em ar sintético na faixa de 4 a 0 ppmv, com fluxo total de 200 cm³/min. Para coleta da respiração foram empregadas sacolas Tedlar (Energética Ltda) de 5 L. Com VS1 e VS2 coletou-se amostras de ar em diferentes horários do dia, antes e após as refeições. Já com VIRC1 e VIRC2 a coleta foi realizada pela manhã. A coleta foi realizada com a precaução de eliminar o volume de espaço morto. A amostra foi transferida para o espectrômetro fotoacústico com auxílio de uma bomba de sucção (Low Flow Sampler – Gilian, LFS-113D) e fluxômetro de controle (ALICAT), a fim de que fossem realizados espectros experimentais variando o número de onda de emissão do LASER de 1045,9 a 1047,0 cm^-1. Confrontou-se os espectros experimentais com os teórico obtidos na base de dados Hitran para assegurar a molécula detectada, e as medidas foram realizadas em triplicata.

Resultado e discussão

Sabendo que a concentração normal de ureia no sangue encontra-se entre 10 e 50 mg/dL, o voluntário VS1 apresentou 33,9 mg/dL de ureia enquanto VS2 apresentou o valor de 24,0 mg/dL em seus exames de sangue, ambos dentro da normalidade. O mesmo pode-se dizer com relação aos níveis de creatinina no sangue dos voluntários saudáveis, uma vez que os níveis normais encontram-se na faixa de 0,6 a 1,4 mg/dL, VS1 apresentou o valor de 1,03 mg/dL enquanto VS2 obteve a concentração de 0,65 mg/dL. Já para os voluntários com IRC os valores de ureia e creatinina encontram-se acima dos níveis de normalidade e foram respectivamente 69 mg/dL e 5,77 mg/dL para VIRC1, enquanto para VIRC2 foram 75 mg/dL e 6,73 mg/dL. Apenas pelas concentrações elevadas de ureia e creatinina no sangue dos voluntários já foi possível perceber que VIRC1 e VIRC2 apresentavam uma disfunção renal. Contudo, conforme mencionado anteriormente o parâmetro adequado para diagnóstico da IRC é o cálculo do Cc. Com os resultados da entrevista realizada com todos os voluntários (Tabela 1) foi possível empregar a equação de Cockcroft-Gault. É possível observar na Tabela 1 que os voluntários saudáveis apresentaram sua função renal normal, com os rins filtrando diariamente uma vazão de sangue entre 90 e 120 mL/min. Ademais, estes voluntários não pertenciam a nenhum grupo de risco para IRC como diabetes, lesão crônica nos rins, ou hipertensão. Enquanto que os voluntários doentes apresentaram valores de Cc muito baixos demonstrando claramente a IRC. Com os resultados de Cc calculados e conforme a classificação da Sociedade Internacional de Nefrologia (2013) foi possível classificar VIRC1 no quarto estágio da doença, denominado estágio severo (15 < Cc < 29 ml/min), enquanto o VIRC2 foi classificado no quinto e último estágio da doença denominado estágio terminal (Cc < 15 mL/min). Em ambos os estágios os pacientes necessitam de terapia renal substitutiva e no estágio terminal é necessário transplante de rins. Com relação ao experimento de detecção de amônia utilizando a EFG-QCL, o resultado da curva de calibração fotoacústica com amônia certificada forneceu um limite de detecção de (3,1 ± 0,2) μV que corresponde a concentração de 0,25 ppmv ou 250 ppbv de amônia. Este resultado impossibilitou a quantificação de amônia exalada pelos voluntários saudáveis, uma vez que a respiração medida em diferentes horários do dia (manhã e tarde) apresentou nos espectros uma amplitude de sinal fotoacústico inferior ao limite de detecção do sistema, isto é, uma concentração de amônia menor que 0,25 ppmv. O fato de indivíduos saudáveis exalarem amônia próximo a 0,25 ppmv é relatado na literatura como um valor de referência para diferenciar estes voluntários dos que apresentam IRC (POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011b; NAVAS; JIMÉNEZ; ASUERO, 2012; WANG et al., 2012). Para quantificar esta exalação o limite de detecção do sistema teria que ser menor, o que futuramente pode ser obtido utilizando um QCL que alcance maiores valores de potência. Verificou-se que a concentração de amônia na respiração dos voluntários doentes VIRC1 e VIRC2 foi maior que no caso dos voluntários saudáveis (< 0,25 ppmv). A média das triplicatas considerando todos os dias de medida da respiração de VIRC1 forneceu o valor de (1,1 ± 0,3) ppmv de amônia, enquanto que para VIRC2 a concentração de amônia detectada na respiração foi de (1,3 ± 0,3) ppmv. Uma vez que com os voluntários controle VS1 e VS2 foram realizadas medidas em diferentes horários do dia e não foi observada amônia detectável, é possível associar a presença de amônia na respiração de VIRC1 e VIRC2 ao fato destes apresentarem IRC em estágio avançado confirmando assim a capacidade da amônia atuar como um biomarcador. Valores de concentração de amônia associados com a IRC e pesquisados na literatura indicaram que no caso de alguns indivíduos doentes a concentração de amônia na respiração pode variar de 1,6 ppmv até 4,79 ppmv, e que estas podem ser reduzida com terapia renal substitutiva para os valores de 0,6 a 1,50 ppmv, o que demonstra que existe uma exalação característica destes indivíduos que sempre estará presente e será maior que no caso de indivíduos saudáveis (NARASIMHAN; GOODMAN; PATEL, 2001; POPA et al., 2011a; POPA et al., 2011 b; WANG et al., 2012). Conforme o desvio padrão da concentração de amônia exalada por VIRC1 e VIRC2 não é possível dizer que estas concentrações sejam diferentes entre si. Contudo, a literatura sugere que para menores valores de Cc e maiores valores de ureia no sangue espera-se uma maior exalação de amônia (NARASIMHAN et al., 2001; POPA et al., 2011a). Sendo assim, pode-se dizer que existe uma tendência de VIRC2 exalar uma concentração maior de amônia, uma vez que este voluntário apresentou um valor menor de Cc (10,5 ml/min) e maior valor de ureia (75 mg/dL) quando comparado a VIRC1.

Conclusões

Esta pesquisa buscou estudar os biomarcadores nitrogenados da insuficiência renal crônica (ureia, creatinina e amônia). Conforme esperado, foi possível demostrar uma relação entre os níveis de ureia no sangue, valores de Clearance de creatinina calculados pela equação de Cockcroft-Gault, e a concentração de amônia detectada na respiração, uma vez que quanto maior o nível de ureia no sangue, maior a concentração de amônia exalada e menor o Clearance de creatinina, o que foi observado na prática. Ademais, a pesquisa contribuiu para o desenvolvimento de estudos que futuramente possam viabilizar monitoramentos e diagnósticos da IRC de maneira não-invasiva por meio da detecção de amônia no hálito humano, o que é extremamente importante porque visa minimizar o sofrimento humano proporcionado por exames invasivos. Apesar do espectrômetro fotoacústico acoplado ao LASER de cascata quântica utilizado ter apresentado limite de detecção (0,25 ppmv), inviabilizando a detecção de amônia oriunda da respiração de voluntários saudáveis, a técnica mostrou-se sensível e seletiva na detecção do referido biomarcador na exalação de voluntários com Insuficiência Renal Crônica em estágios avançados.

Agradecimentos

Os autores agradecem às instituições de fomento CAPES, FAPERJ e CNPq, universidades UENF e FMC, hospital PRORIM de Campos dos Goytacazes, e a todos os voluntários.

Referências

ABENSUR, Hugo. Biomarcadores na Nefrologia. Sociedade Brasileira de Nefrologia, 2011.

BAPTISTA FILHO, Milton. et al. Ammonia detection by using quantum-cascade laser photoacoustic spectroscopy. Applied Optics, v. 45, n. 20, jul. 2006.

BASTOS, Marcus Gomes et al. Doença Renal Crônica: Problemas e Soluções. J Bras Nefrol, v. 26, n. 4, 2004.

BASTOS, Marcus Gomes et al. Prevalência da doença renal crônica nos estágios 3, 4 e 5 em adultos. Rev Assoc Med Bra, v. 55, n. 1, 2009.

BASTOS, Marcus Gomes et al. Doença renal crônica: frequente e grave, mas também prevenível e tratável. Rev Assoc Med Bras, v. 56, n. 2, 2010.

BORTOLOTT, Luiz Aparecido. Arterial hypertension and chronic renal failure. Rev Bras Hipertens, v. 15, n. 3, 2008.

BURMEISTER, J. E. et al. Creatinina plasmática normal significa função renal normal? Revista da AMRIGS, v. 51, n. 2, 2007.

BUSZEWSKI, B. et al. Human exhaled air analytics: biomarkers of diseases. Biomedical Chromatography, v. 21, abr. 2007.

DUMITRAS, D. C. et al. Investigation of human biomarkers in exhaled breath by laser photoacoustic spectroscopy. Advanced Laser Technologies, v. 5850, 2005.

INTERNATIONAL SOCIETY OF NEPHROLOGY. KDIGO 2013 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease. Kidney International Suplements, v.3, 2013.

KIM, K.-H.; JAHAN, Shamin Ara; KABIR, Ehsanul. A review of breath analysis for diagnosis of human health. Trends in Analytical Chemistry, v. 33, 2012.

KOSTEREV, A. et al. Application of quantum cascade lasers to trace gas analysis. Appl. Phys. B, v. 90, 2008.

LOURENÇO, Célia; TURNER, Claire. Breath Analysis in Disease Diagnosis: Methodological Considerations and Applications. Metabolites, v. 4, jun. 2014.

MCCURDY, Matthew R. et al. Recent advances of laser-spectroscopybased techniques for applications in breath analysis. Journal of breath research, v. 1, 2007.

MIKLÓS, András; HESS, Peter; BOZÓKI, Zoltán. Application of acoustic resonators in photoacoustic trace gas analysis and metrology. Review of Scientific Instruments, v. 72, n. 4, 2001.

NAPOLI FILHO, Marco Di et al. Estimation of Renal Function by the Cockcroft and Gault Formula in Overweighted or Obese Patients. J Bras Nefrol, v. 30, n. 3, 2008.

NARASIMHAN, L. R. et al. Correlation of breath ammonia with blood urea nitrogen and creatinine during hemodialysis. PNAS, v. 98, n. 8, p. 4617-4621, abr. 2001.

NAVAS, M.J.; JIMÉNEZ, A.M.; ASUERO, A.G. Human biomarkers in breath by photoacoustic spectroscopy. Clinica Chimica Acta, v. 413, p. 1171-1178, 2012.

POPA, C. et al. Qualitative and Quantitative Determination of Human Biomarkers by Laser Photoacoustic Spectroscopy Methods. Laser Physics, v. 21, n. 7, p. 1336-1342, jun. 2011a.

POPA, C. et al. Ethylene and ammonia traces measurements from the patients’ breath with renal failure via LPAS method. Appl Phys B, v. 105, 2011b.

RISBY, Terence H.; TITTEL, Frank k. Current status of midinfrared quantum and interband cascade lasers for clinical breath analysis. Optical Engineering, v. 49, n. 11, nov. 2010.

SIGRIST, Markus W. Trace gas monitoring by laser photoacoustic spectroscopy and related techniques (plenary). Review of Scientific Instruments, v. 74, n. 1, p. 486-490, 2003.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA. SBN Informa Publicação Oficial da Sociedade Brasileira de Nefrologia. SBN, n. 101, 2015. Disponível em:< http://sbn.org.br/app/uploads/sbninforma101_2015.pdf>. Acesso em: 03 fev. 2017.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA. SBN Informa Publicação Oficial da Sociedade Brasileira de Nefrologia. SBN, n. 105, 2016. Disponível em:< http://sbn.org.br/app/uploads/sbninforma105_2016_bx-1.pdf>. Acesso em: 03. Fev. 2017.

SODRÉ, Fábio L. et al. Evaluation of renal function and damage: a laboratorial challenge. J Bras Patol Med Lab, v. 43, n. 5, 2007.

TITTEL, Frank K et al. Real time detection of exhaled human breath using quantum cascade laser based sensor technology. Proc. of SPIE, v. 8223, 2012.

WANG, Chuji; SAHAY, Peeyush. Breath Analysis Using Laser Spectroscopic Techniques: Breath Biomarkers, Spectral Fingerprints, and Detection Limits. Sensors, v. 9, 2009.

WANG, J. W. et al. Tunable Fiber Laser Based Photoacoustic Spectrometer for Breath Ammonia Analysis During Hemodialysi. LASER METHODS IN CHEMISTRY, BIOLOGY, AND MEDICINE, v. 22, n. 1, 2012.

WOJTAS, J. et al. Ultrasensitive laser spectroscopy for breath analysis. Opto−Electronics Review, v. 20, n. 1, p. 26-39, 2012.

WOJTAS, J. et al. Cavity-Enhanced Absorption Spectroscopy and Photoacoustic Spectroscopy for Human Breath Analysis. Int J Thermophys, n. 35, p. 2215–2225, abr. 2014.