Purificação simultânea de C-ficocianina e anidrase carbônica utilizando precipitação fracionada por sal

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Alimentos

Autores

Jantzen da Silva Lucas, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Simões Corrêa Junior, L.C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Sala, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Juliano Kalil, S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE)

Resumo

O objetivo do presente estudo foi purificar simultaneamente, a partir do extrato de biomassa úmida de Spirulina platensis LEB-52, os bioprodutos C-ficocianina (C-FC) e anidrase carbônica (AC) utilizando precipitação fracionada. A microalga foi cultivada em meio Zarrouk 100%, a extração foi assistida por ultrassom e a purificação simultânea dos bioprodutos foi realizado por precipitação fracionada com sulfato de amônio nas faixas de saturação de 0-20%/ 20-50%. Conforme esperado, a C-FC foi recuperada na fração precipitada com pureza de grau alimentar (0,78), e a AC foi recuperada no sobrenadante com atividade enzimática de 0,14 U/mL. Pode-se concluir que é possível obter dois bioprodutos purificados através de uma única técnica de purificação.

Palavras chaves

[i]Spirulina[/i]; Purificação; Precipitação

Introdução

O crescente interesse no estudo de micro-organismos como microalgas, fungos e bactérias deve-se à importância destes nas diversas cadeias tróficas e na possibilidade da aplicação comercial em distintas áreas como na nutrição, saúde humana e animal, no tratamento de águas residuais, na produção de energia e na obtenção de compostos de interesse das indústrias alimentícia, química e farmacêutica, dentre outras (DERNER, 2006). Dentre os diversos compostos que podem ser obtidos da biomassa de Spirulina destacam-se a anidrase carbônica (AC) e a C-ficocianina (C-FC) (ORES; AMARANTE; KALIL, 2016). A C-FC é uma ficobiliproteína que pode ser utilizada como pigmento natural em alimentos, tais como goma de mascar, produtos lácteos, geleias (SANTIAGO- SANTOS et al., 2004), sorvetes, sobremesas e bebidas não alcoólicas (SONANI et al., 2016), também apresentam uma variedade de efeitos benéficos a saúde, como ação antioxidante, anti-inflamatória (DENG; CHOW, 2010), antitumoral (LI et al., 2015), dentre outros. A anidrase carbônica (EC 4.2.1.1) é uma metaloenzima, que contém um átomo de zinco na sua conformação, e catalisa a hidratação reversível do CO₂ em bicarbonato com alta eficiência (SHEKH et al., 2012), sendo utilizada industrialmente em sistemas de captura enzimática de CO₂ atmosférico (VINOBA et al., 2012), poluente considerado como maior contribuinte para o efeito estufa (IPCC, 2001). No processo enzimático de captura de CO₂, ocorre primeiramente a hidratação do CO₂, catalisada pela enzima e posterior fixação química na forma de carbonato, este é um método seguro e permanente de eliminação de CO₂, pois os mesmos encontram-se em abundância na natureza e são ambientalmente seguros e estáveis (MIRJAFARI; ASGHARI; MAHINPEY, 2007). Devido as diversas aplicações em vários campos, torna-se essencial desenvolver um método fácil e rentável para a purificação de bioprodutos de origem microalgal a fim de atender a crescente demanda (BERMEJO ROMÁN et al., 2002). A purificação de produtos biotecnológicos pode envolver etapas de precipitação, ultrafiltração, sistema aquoso bifásico, ou a combinação destes, seguidos de uma ou mais etapas cromatográficas, como cromatografia de troca iônica, de afinidade, de interação hidrofóbica ou de adsorção. A finalização geralmente é feita com etapa de filtração em gel, secagem, cristalização ou liofilização do produto de interesse (KILIKIAN; PESSOA JR, 2005). Entre os processos de purificação inicial estão a precipitação por sal ou por solvente, onde estes irão modificar a solubilidade da proteína. A precipitação é uma das operações mais adotadas, tanto em escala laboratorial quanto industrial para purificação de proteínas (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995). O fracionamento em “dois-cortes” ou “dois-estágios” pode ser empregado quando os meios que contém a proteína a ser purificada apresentam misturas de diferentes biomoléculas, removem-se primeiro as proteínas indesejáveis, e após precipitam-se uma ou mais biomoléculas alvo. Por ser acessível economicamente, o sulfato de amônio é um dos sais mais utilizados para precipitar proteínas, podendo ser eliminado posteriormente da suspensão por diálise ou ultrafiltração para que se possa continuar com as etapas de purificação (KILIKIAN; PESSOA JR, 2005). Na literatura são encontrados trabalhos que avaliam a purificação de C-ficocianina (CHAIKLAHAN et al., 2011; FIGUEIRA, 2014; MORAES et al., 2011; PATEL et al., 2005; SILVA et al., 2009; SONI et al., 2006) e anidrase carbônica extraída a partir de microalgas (HILTONEN et al., 1995; KARLSSON et al., 1995). Ores (2014) realizou a extração conjunta de ficobiliproteínas e da enzima anidrase carbônica a partir de biomassa microalgal, no entanto até o presente momento não se tem conhecimento de estudos que purifiquem/ separem simultaneamente os dois bioprodutos. Mediante o exposto o presente trabalho teve por objetivo purificar simultaneamente, a partir do extrato de biomassa úmida de Spirulina platensis LEB-52, os bioprodutos C-ficocianina e anidrase carbônica utilizando precipitação fracionada com sulfato de amônio.

Material e métodos

A cepa de cianobactéria Spirulina platensis LEB-52, gentilmente cedida pelo Laboratório de Engenharia Bioquímica da Escola de Química e Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande (FURG), foi utilizada para obtenção simultânea dos bioprodutos C- FC e AC. Para o preparo do inóculo, cultivo e manutenção da microalga foi utilizado o meio Zarrouk 100% (ZARROUK, 1996). Os cultivos foram realizados em Erlenmeyer de 2 L segundo Sala (2017). Ao término do cultivo, a biomassa foi recuperada por filtração em papel filtro qualitativo (Fitec) de fibra vegetal e espessura 0,2 mm, ressuspendida em tampão Tris-SO₄ 50 mM pH 7,4 e destinada a extração assistida por ultrassom (EAU). A EAU foi realizada utilizando homogenizador ultrassônico (Sonic Ruptor 250, Omni International Inc., EUA) com frequência de 20 kHz (ponteira micro) conforme proposto por Ores (2014). O tempo de ruptura celular foi de 12 min (SALA, 2017). Após, as suspensões foram centrifugadas e o sobrenadante utilizado para os ensaios de purificação. O extrato obtido foi concentrado e purificado por precipitação fracionada com sulfato de amônio segundo Figueira (2014), as faixas de saturação (0-20% / 20-50%) foram escolhidas de acordo com estudos feitos por Moraes (2006). Os ensaios foram realizados em triplicata. A influência do sal sobre a atividade da AC foi realizada aplicando diferentes faixas de saturação (0, 5, 7,5, 10, 12,5, 15 e 20%) no extrato bruto. A eficiência do processo foi avaliada em termos de fator de purificação e recuperação para C-FC e AC. O fator de purificação foi calculado pela razão entre a concentração específica de C-FC (mg/mg)_proteína na saída e a concentração específica de C-FC (mg/mg)_proteína na entrada, para AC o fator de purificação foi calculado pela razão entre a atividade específica de AC (U/mg)_proteína na saída e a atividade específica de AC (U/mg) _proteína na entrada. O percentual de recuperação foi calculado pela razão entre a concentração total de C-FC (mg) na saída e a concentração total de C-FC (mg) na entrada. Para AC o percentual de recuperação foi calculado pela razão entre atividade total (U) na saída e a atividade total (U) na entrada. A concentração de C-FC foi calculada como descrito por Bennett e Bogorad (1973), a pureza de C-FC foi calculada pela razão entre as absorvâncias a 620 nm e a 280 nm. A atividade enzimática da anidrase carbônica foi monitorada através da atividade de esterase segundo metodologia de Pocker e Stone (1967). A concentração de biomassa foi determinada conforme Costa et al. (2002) e conversão para biomassa seca através de curva padrão previamente preparada. A determinação de proteínas foi realizada nas frações precipitada, sobrenadante e extrato inicial segundo metodologia descrita por Lowry et al. (1951), utilizando albumina de soro bovino como padrão, e também foi acompanhada por leitura em espectrofotômetro-UV a 280 nm.

Resultado e discussão

Através dos ensaios de precipitação fracionada realizados esperava-se encontrar uma maior concentração de C-ficocianina na fração precipitada do segundo corte (MORAES, 2006) e uma maior atividade de anidrase carbônica na parcela do sobrenadante, possibilitando assim a separação simultânea dos dois bioprodutos. Analisando as frações (precipitado e sobrenadante) individualmente, pode-se perceber que a precipitação fracionada com sulfato de amônio se mostrou uma técnica eficaz para a purificação simultânea da C-ficocianina e anidrase carbônica, uma vez que, conforme esperado a C-ficocianina foi obtida na fração precipitada e a anidrase carbônica na fração sobrenadante, resultados estes apresentados na Tabela 1. C-ficocianina é comercializada de acordo com seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 (grau alimentar) a 4,0 (grau analítico) (RITO-PALOMARES; NUEZ; AMADOR, 2001). Com base nos resultados da Tabela 1, verificou-se que o processo aplicado possibilitou a obtenção de extrato de C-ficocianina com pureza de grau alimentar (0,78) e concentração de 1,3 mg/mL. Em estudo feito por Silva et al. (2009) valores semelhantes para pureza (0,72 e 0,88) e concentração (1,69 mg/mL e 1,66 mg/mL) de C-ficocianina foram encontrados para precipitação com 50% de saturação e fracionamento nas faixas de 0-20% /20-50% respectivamente. Moraes (2006) reproduziu a mesma faixa de fracionamento de Silva et al. (2009) e obteve o mesmo valor de pureza (0,88) e concentração (1,6 mg/mL). A recuperação de 74,9% obtida neste estudo se assemelha a recuperação de 75% obtida por Román et al. (2002), o qual utilizou precipitação de 65% de saturação com sulfato de amônio para recuperar ficoeritrina de Porphyridium cruentum. Figueira (2014) e Moraes (2006) utilizaram precipitação fracionada com faixa de saturação de 0-20% / 20-50% para purificar C-ficocianina de Spirulina platensis e obtiveram recuperação de 81,2% e 83,3% respectivamente. Silva et al. (2009) obteve 91,7% de recuperação com fracionamento na faixa de 50% de saturação a fim de purificar C- ficocianina de Spirulina platensis. Diversos estudos utilizam a precipitação com sulfato de amônio para purificação de enzimas (FIGUEIRA, 2014; MOHAMED et al., 2016; MORAES et al., 2011; YAN et al., 2011; PURWANTO, 2016) antes de se aplicar um método mais sofisticado para a purificação de uma proteína. Por outro lado, o passo de precipitação muitas vezes provoca alterações no rendimento e na atividade da proteína. De acordo com a Tabela 1, a enzima anidrase carbônica apresentou atividade de 0,14 U/mL, fator de purificação de 133,8 vezes e recuperação de 976,8%, valor este muito elevado. Partindo do pressuposto de que o sal utilizado poderia aumentar a atividade enzimática da anidrase carbônica a influência do sal foi estudada, e os resultados obtidos estão apresentados na Figura 1. A atividade da anidrase carbônica (U/mL) aumenta conforme o incremento na concentração de sal, isto pode explicar os valores elevados de recuperação e purificação, uma vez que estes dois parâmetros são dependentes da atividade enzimática.

A Figura 1 mostra que o aumento na concentração de sulfato de amônio durante a precipitação promoveu o aumento da atividade da anidrase carbônica.


A Tabela 1 apresenta os valores de concentração, atividade, fator de purificação, recuperação e pureza para C-ficocianina e anidrase carbônica.

Conclusões

De acordo com o presente estudo, pode-se concluir que é possível obter dois bioprodutos purificados através de uma só técnica de purificação, uma vez que a C-ficocianina se localizou na fração precipitada e a anidrase carbônica na fração sobrenadante. Utilizando precipitação fracionada na faixa de 0-20% / 20-50% de saturação obteve-se C-ficocianina com pureza de grau alimentar (0,78), concentração de 1,3 mg/mL, recuperação de 74,9% e fator de purificação de 1,7 vezes em relação ao extrato inicial. A enzima anidrase carbônica apresentou valores de atividade enzimática de 0,14 U/mL com fator de purificação 133,8 vezes e recuperação de 976,8%, valores estes explicados devido a influência do sal sobre a atividade da enzima.

Agradecimentos

CNPq, FAPERGS, Capes e PIBIC/CNPq

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