Produção de enzimas xilanolíticas e xilo-oligossacarídeos pela levedura Aureobasidium pullulans

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Alimentos

Autores

Gautério, G.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Cardoso, M.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; da Silva, L.G.G. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE) ; Kalil, S.J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE)

Resumo

O presente trabalho investigou a produção simultânea de enzimas xilanolíticas e xilo-oligossacarídeos (XOS) por diferentes cepas da levedura Aureobasidium pullulans (CCT 7521, CCT 4154 e CCT 1261). O meio de cultivo teve a xilana de madeira de faia como principal substrato. A produção de enzimas xilanolíticas e XOS, além do pH e biomassa, foi acompanhada por 96 h de cultivo. Dentre as cepas estudadas, a CCT 1261 apresentou maior produção de endo-β-1,4-xilanase (74,94 ± 0,76 U/mL), biomassa (4,11 ± 0,15 g/L), μmax (0,18 ± < 0,01 1/h) e produtividade enzimática máxima (1,25 ± 0,01 U/mL.h), e menor relação β-xilosidase/endo- β-1,4-xilanase (0,002). A produção total de XOS foi de 1,57 ± 0,06 mg/mL em 12 h de cultivo, sendo composta majoritariamente por xilobiose e xilotriose.

Palavras chaves

cultivo submerso; endo-β-1,4-xilanase; xilo-oligossacarídeos

Introdução

A biomassa lignocelulósica pode ser considerada a matéria-prima renovável mais abundante e amplamente distribuída na natureza, compreendendo majoritariamente os materiais oriundos da agroindústria, resíduos urbanos e florestais (JÖNSSON; MARTÍN, 2016). Existem diversos substratos lignocelulósicos potencialmente utilizáveis na obtenção de produtos de alto valor agregado como biocombustíveis, biofilmes, enzimas, açúcares, entre outros (CHAPLA;PANDIT; SHAH, 2012). Materiais como palha, bagaço de cana, sabugo de milho, torta de malte, amêndoas, madeira, casca e farelo de alimentos, possuem a fração hemicelulósica constituída principalmente por xilana (GULLÓN et al., 2010), heteropolissacarídeo formado por subunidades de xilose unidas por ligações β-1,4 e cadeias laterais de arabinose, galactose, manose, glicose e ácidos (GOWDHAMAN; PONNUSAMI, 2015). Devido à complexidade estrutural da xilana, a transformação desses materiais em produtos de aplicação industrial, tais como xilose, xilitol e xilo- oligossacarídeos (XOS), requer que um sistema múltiplo de enzimas com distintas especificidades e modos de ação atue na quebra da cadeia desse polissacarídeo (GOWDHAMAN; PONNUSAMI, 2015). Dentre as enzimas que compõem o complexo xilanolítico, duas merecem destaque: a endo-β-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8), a qual está envolvida na quebra das ligações glicosídicas β-1,4 e liberações de pequenas frações de açúcares (XOS); e a β-xilosidase (EC 3.2.1.37), que atua na extremidade não redutora da xilobiose ou de outros XOS, resultando em xilose (SHENG et al., 2014). As endo-β-1,4-xilanases são aplicadas principalmente na indústria de papel e celulose (BORUAH et al., 2016), de alimentos (LI et al., 2013; SHAHRESTANI et al., 2016; VERJANS et al., 2010) e de rações (VANDEPLAS et al., 2010), de modo a facilitar processos industriais e melhorar características tecnológicas ou nutricionais. Dentre as aplicações alimentícias, as endo-β-1,4-xilanases têm sido estudadas como biocatalisadores na produção de XOS a partir de materiais lignocelulósicos (CHAPLA; PANDIT; SHAH, 2012; FARYAR et al., 2015; REDDY; KRISHNAN, 2016), uma vez que a reações envolvidas contam com a especificidade enzimática, ocorrem em condições brandas de temperatura e não formação de compostos tóxicos (CHAPLA; PANDIT; SHAH, 2012; YANG et al., 2011). Os XOS são oligômeros não digeríveis contendo entre duas a dez unidades de xilose unidas por ligações β-1,4 (MONIZ et al., 2014). Devido à sua atoxicidade, certificação GRAS (Generally Recognized as Safe), propriedades bioativas e funcionais, os XOS podem ser utilizados como adoçantes de baixa caloria e na formulação de alimentos e bebidas prebióticas (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2013). Quando aplicados para fins de produção de XOS, complexos enzimáticos com alta atividade de endo-β-1,4- xilanase e baixa atividade de β-xilosidase são desejados, pois atenuam a produção de xilose e aumentam o rendimento de XOS (VÁZQUEZ et al., 2002). Organismos como fungos filamentosos (AHMED et al., 2016) e bactérias (IRFAN et al., 2016) são capazes de secretar endo-β-1,4-xilanases em grandes quantidades. No entanto, algumas espécies secretam concomitantemente celulases (ANG et al., 2013; DOS REIS et al., 2013) e β-xilosidases (TERRASAN et al., 2013), esta última responsável pelo acúmulo de xilose e possível inibição da atividade de endo-β-1,4-xilanases (VÁZQUEZ et al., 2002). Por outro lado, o uso leveduras na produção de endo-β-1,4-xilanases tem se mostrado promissor para obtenção de extratos enzimáticos mais homogêneos, uma vez que essas podem produzir endo-β-1,4-xilanases livres de celulases e β-xilosidases com menor atividade enzimática (OTERO et al., 2015), levando à uma menor quantidade de xilose residual no meio extracelular. Estudos têm mostrado a levedura Aureobasidum pullulans como produtora de endo-β-1,4-xilanases com alta atividade enzimática (CHRISTOV et al., 1997; YEGIN, 2017), mesmo quando utilizado substratos lignocelulósicos agroindustriais no meio de cultivo (YEGIN et al., 2016). Adicionalmente, existem poucos relatos na literatura que abordam a produção simultânea de XOS e enzimas xilanolíticas por espécies microbianas (MENEZES; ROSSI; AYUB, 2017; PUCHART; BIELY, 2008). Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção simultânea de enzimas xilanolíticas e XOS pela levedura Aureobasidum pullulans em cultivo submerso.

Material e métodos

Três cepas da levedura Aureobasidium pullulans (CCT 7521, CCT 4154 e CCT 1261), adquiridas da Fundação André Tosello, foram avaliadas quanto à produção simultânea de enzimas xilanolíticas e XOS. As cepas da levedura foram reativadas através do repique para ágar batata dextrose inclinado (WEI et al., 2017) a partir das cepas estoques, sendo posteriormente mantidas a 24°C por 72 h (YEGIN et al., 2016). O preparo do pré-inóculo consistiu na transferência da massa celular contida na superfície do ágar para tubos contendo 5 mL de meio estéril composto por (g/L): xilose (10), base nitrogenada de levedura (6,7), asparagina (2) e KH₂PO₄ (5) em pH 5,0 (CHRISTOV et al., 1997). Os tubos foram incubados a 28°C durante 24 h. Para o crescimento do inóculo, o volume correspondente ao pré- inóculo (5 mL) foi vertido para Erlenmeyers contendo 45 mL do mesmo meio estéril, os quais foram mantidos a 28°C e 150 rpm (agitação orbital) durante 24 h. Os cultivos foram conduzidos utilizando 150 mL meio estéril contido em frascos Erlenmeyers aletados composto por (g/L): xilana de madeira de faia (10), extrato de levedura (1), (NH₄)SO₄ (2,5) e KH₂PO₄ (5) em pH 5,0 (YEGIN, 2017). Os frascos contendo o meio estéril foram inoculados com 2% (v/v) de inóculo com densidade ótica (DO) a 620 nm padronizada em 0,8 (SUGUMARAN et al., 2013), e mantidos a 28°C, 150 rpm (agitação orbital) por 96 h. Amostras do cultivo foram coletadas a cada 12 h e centrifugadas a 21.380 × g e 4°C durante 5 min. O sobrenadante livre de células foi analisado quanto à atividade de endo-β-1,4-xilanase (BAILEY; BIELY; POUTANEN, 1992) e quantificação de açúcares redutores (MILLER, 1959), atividade de β-xilosidase (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987) e pH (AOAC, 2000). Todos os cultivos foram realizados em triplicata. Após filtragem em membrana de fluoreto de polivinilideno (0,22 µm de poros), o sobrenadante também foi analisado quanto à presença de XOS por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando coluna Aminex HPX-42A (Bio-Rad, Califórnia, Estados Unidos) para a análise de carboidratos e padrões analíticos de xilose e XOS com diferentes graus de polimerização (GP) (GUIDO et al., 2017). O precipitado da centrifugação foi analisado quanto à concentração de biomassa a 620 nm, correlacionando as leituras com as respectivas curvas de calibração de biomassa seca de cada cepa (GALIOTOU-PANAYOTOU; KALANTZI; AGGELIS, 1998). Os parâmetros cinéticos como velocidade máxima específica de crescimento (μmax) e a produtividade enzimática máxima (P), foram calculados a partir da curva de crescimento de cada cepa em estudo (HISS, 2001).

Resultado e discussão

A Figura 1a apresenta o acompanhamento da produção de endo-β-1,4-xilanase pelas três cepas de Aureobasidium pullulans em estudo. A cepa CCT 1261 (AP3) apresentou a maior atividade de endo-β-1,4-xilanase (74,94 ± 0,76 U/mL) em comparação às demais cepas estudadas, sendo a produção máxima alcançada em 60 h. As cepas CCT 7521 (AP1) e CCT 4154 (AP2) apresentaram atividade máxima de endo-β-1,4-xilanase de 2,60 ± 0,06 U/mL e 3,37 ± 0,21 U/mL, respectivamente, em 36 h de cultivo. Para o mesmo tempo de cultivo (36 h), a cepa AP3 já havia produzido endo-β-1,4-xilanase com atividade de 45,33 ± 1,99 U/mL. A produção de endo-β-1,4-xilanase pode variar conforme a cepa utilizada, segundo o estudo de Yegin (2017), o qual avaliou a produção de endo-β-1,4-xilanase por três cepas de Aureobasidium pullulans (DMS 2404, NRRL Y-2311-1 e NRRL Y12, 974). A cepa Y-2311-1 se mostrou a maior produtora da enzima, alcançando a atividade máxima de 252,78 U/mL após 96 h de cultivo em meio otimizado contendo xilana. Valores de atividade de endo-β-1,4-xilanase semelhantes aos observados para as cepas AP1 e AP2 foram observados por Nars et al. (2013), onde o valor máximo de 2,73 U/mL foi alcançado para a levedura Aureobasidium pullulans SN090. Conforme mostra a Figura 1b, todas as cepas em estudo produziram β- xilosidase, cuja atividade aumentou no decorrer do cultivo. Embora as três cepas tenham apresentado baixos níveis de β-xilosidase após 96 h, a relação β-xilosidase/endo-β-1,4-xilanase foi menor para a cepa AP3 (0,002) em comparação às cepas AP1 (0,07) e AP2 (0,119). O uso de extratos enzimáticos com baixa relação entre β-xilosidase/endo-β-1,4-xilanase são preferíveis na produção de XOS, pois atenuam a produção de xilose que pode inibir a atividade de endo-β-1,4-xilanase (VÁZQUEZ et al., 2002) e originar mistura de XOS mais impuras e com menor atividade prebiótica (ESCARNOT; AGUEDO, PAQUOT, 2012). Com base nos níveis de endo-β-1,4-xilanase e β-xilosidase, a cepa AP3 se mostrou a mais indicada para posterior produção de XOS por hidrólise enzimática. Em relação ao pH (Figura 1c), as três cepas apresentaram decréscimo em seu valor nas 24 h de cultivo: 3,75 ± 0,12 para AP1, 3,75 ± 0,03 para AP2 e 3,76 ± 0,03 para AP3. Para as cepas AP1 e AP2, os valores de pH aumentaram após 24 h, alcançando os valores máximos de 5,69 ± 0,06 e 5,62 ± 0,03, respectivamente, às 96 h de cultivo. Esse comportamento foi semelhante ao observado por Yegin et al. (2016) durante a produção de endo-β-1,4-xilanase por Aureobasidium pullulans Y-2311-1, onde houve decréscimo no pH nas primeiras 24 h, bem como o aumento dos seus valores ao longo do cultivo. Por outro lado, a cepa AP3 apresentou menor variação do pH após 24 h, se mantendo entre 3,52 ± 0,03 (36 h) e 3,88 ± 0,08 (84 h), e alcançando o valor máximo de 4,10 ± 0,15 ao término do cultivo (96 h). Quanto à produção de biomassa (Figura 1d), a cepa AP3 foi a que mais se destacou em termos de crescimento celular, uma vez que alcançou o valor máximo de 4,11 ± 0,15 g/L às 72 h de cultivo. Já para as cepas AP1 e AP2, a concentração de biomassa máxima foi de 3,37 ± 0,17 g/L (72 h) e 2,99 ± 0,12 g/L (48 h), respectivamente. A velocidade específica de crescimento máxima (μmax) apresentou valor de 0,12 ± 0,01 1/h, 0,16 ± < 0,01 1/h e 0,18 ± < 0,01 1/h para as cepas AP1, AP2 e AP3, nesta ordem. A produtividade (P) máxima em termos de endo-β-1,4-xilanase para as cepas AP1, AP2 e AP3 foi de 0,07 ± < 0,01 U/mL.h, 0,09 ± < 0,01 U/mL.h e 1,25 ± 0,01 U/mL.h, respectivamente. A produção de XOS para as cepas AP2 e AP3 foi constatada nas primeiras 12 h de cultivo e em baixas concentrações, não sendo detectada a presença de xilopentose (Tabela 1). Para a cepa AP3, a presença de xilotriose (0,06 mg/mL) e xilose (0,34 mg/mL) foi constatada também em 24 h de cultivo. Já para a cepa AP1, foi observada a presença de xilose (1,65 mg/mL), xilobiose (0,13 mg/mL) e xilotriose (0,07 mg/mL) após 24 h de cultivo, bem como xilose após 36 h (0,57 mg/mL), 48 h (0,08 mg/mL) e 72 h (0,07 mg/mL). Devido à ausência de XOS nas demais horas de cultivo, é possível supor que a levedura utiliza os oligossacarídeos produzidos como fonte de nutrientes para o seu crescimento. Menezes, Rossi e Ayub (2017) ao avaliar a produção de XOS e endo-β-1,4-xilanase por Aspergillus brasiliensis BLf1 em cultivo em estado sólido, observaram que a produção de oligossacarídeos ocorreu nas primeiras 48 h de cultivo, não coincidindo com o pico de produção máxima da enzima. Os maiores níveis de XOS para as três cepas foram em termos de xilobiose e xilotriose, conforme mostra a Tabela 1. Segundo Van Craeyveld et al. (2008), o efeito prebiótico dos XOS depende da sua fermentação por bactérias do cólon, fato este relacionado com a sua estrutura e o grau de polimerização (GP). XOS com GP igual ou inferior a cinco proporcionam o crescimento de bifidobactérias importantes para a manutenção da microflora intestinal saudável, enquanto que XOS com GP maiores não estimulam o desenvolvimento bacteriano. Assim, para aplicação em alimentos com alegação prebiótica, XOS com GP entre 2 a 4 são desejáveis. Com base nos resultados acima apresentados, a cepa CCT 1261 (AP3) se mostrou a mais eficiente para a produção de endo-β-1,4-xilanase e com baixa produção de β-xilosidase. Apesar dos baixos níveis de XOS produzidos em cultivo submerso, cabe ressaltar que há necessidade de otimizar as condições de cultivo da levedura, visando à maior produção concomitante de endo-β-1,4- xilanase e XOS.

Figura 1 - Acompanhamento da atividade de (a) endo-β-1,4-xilanases e (b) β-xilosidase, (c) pH e (d) biomassa no cultivo de Aureobasidium pullulans


Tabela 1 - Xilo-oligossacarídeos (XOS) produzidos por Aureobasidium pullulans CCT 7521 (AP1), CCT 4154 (AP2) e CCT 1261 (AP3) em 12 h de cultivo

Conclusões

A produção simultânea de enzimas xilanolíticas e xilo-oligossacarídeos (XOS) em cultivo submerso por três cepas da levedura Aureobasidium pullulans foi investigada. A cepa CCT 1261 (AP3) se destacou na produção de endo-β-1,4- xilanase (74,94 ± 0,76 U/mL), apresentando atividade enzimática máxima em 60 h de cultivo, e menor relação β-xilosidase/endo-β-1,4-xilanase (0,002). A cepa também se destacou quanto ao crescimento celular (4,11 ± 0,15 g/L), velocidade específica de crescimento máxima (0,18 ± < 0,01 1/h) e produtividade máxima em termos de endo-β-1,4-xilanase (1,25 ± 0,01 U/mL.h). A produção de XOS pela cepa AP3 foi verificada nas primeiras 12 h de cultivo, alcançando a concentração total de 1,57 ± 0,06 mg/mL, e sendo composto majoritariamente por xilobiose e xilotriose.

Agradecimentos

A Capes, CNPq e FAPERGS.

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