Estudo da interação entre derivados β-carbolínicos biologicamente ativos e ctDNA (Calf Thymus) por meio de técnicas espectroscópicas

ISBN 978-85-85905-21-7

Área

Química Orgânica

Autores

de Magalhães Silva, M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Thayanny de Oliveira Pereira, K. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Carinhanha Caldas Santos, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Martins Figueiredo, I. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; A. Barbosa, V. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ) ; Sarragiotto, M.H. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ)

Resumo

Nesse trabalho foi avaliado a interação de quatro compostos β-Carbolínicos com ctDNA (Calf Thymus) por meio de técnicas espectroscópicas de absorção no UV- visível e fluorescência molecular. Os resultados obtidos a partir de estudos com KI e brometo de etídeo, mostraram que a formação do complexo supramolecular ocorre preferencialmente via intercalação. A constante de ligação (Kb) variou na faixa 1,204 a 118,7 x 104 L mol-1.

Palavras chaves

Interação com ctDNA; Derivados β-Carbolínicos; Técnicas espectroscópicas

Introdução

Nos últimos anos, diversos estudos sobre a interação de pequenas moléculas com o DNA têm ganhado espaço no meio científico, uma vez que esta macromolécula é o principal alvo farmacológico de várias doenças, como câncer, leishmaniose e malária (SHARMA, et al., 2016). Dessa forma, o estudo mencionado promove um maior entendimento do mecanismo dessa ligação, permitindo assim que novos fármacos mais promissores sejam elaborados. As técnicas utilizadas, absorção no UV-visível e fluorescência molecular, têm sido importantes ferramentas para caracterizar a natureza do complexo supramolecular formado, DNA-ligante e os efeitos da interação sobre a estrutura do DNA (SIRAJUDDIN; ALI; BADSHAH, 2013). Estudos revelaram que compostos contendo o núcleo β-Carbolinas são agentes multifuncionais em potencial que possuem uma afinidade de ligação elevada ao DNA e diversas atividades biológicas (HORTON, et al., 2016; ROGGERO, et al., 2014; SILVA, M. M., 2016), principalmente antitumoral, além de que substituições apropriadas nas posições 1, 3 e 9 do anel β-carbolínico pode elevar a atividade dos fármacos e reduzir a toxicidade e efeitos neurotóxicos (BARBOSA, et al., 2016). Por este motivo, as β-carbolinas têm se tornado alvos atrativos da comunidade sintética. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interação de quatro compostos β-carbolínicos, com atividade antiproliferativa (Esquema 1.1), sintetizados pelo grupo de pesquisa da Profª Maria Helena Sarragiotto, do Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá (BARBOSA, et al., 2016) e ctDNA por meios de técnicnas espectroscópicas.

Material e métodos

Os reagentes utilizados foram de alto grau de pureza. Foi utilizada solução tampão Tris-HCl (50 mM, pH = 7,4) com 100 mM de NaCl para ajuste da força iônica. Os compostos foram preparados em DMSO (USA, Sigma Aldrich) e, para análise fez-se a diluíção em solução tampão. O estoque do DNA Calf thymus (ctDNA, USA, Sigma Aldrich) foi feito em solução tampão e, para avaliar se o ácido nucleico estava livre de proteína, mediu-se a absorvância (em espectrofotômetro Micronal de feixe duplo modelo AJX-6100PC) em 260 e 280 nm, onde a razão A260/A280 = 1,8-1,9, indica que a macromolécula está sem contaminação. Posteriormente, o cálculo da concentração do DNA foi feito através equação de Lambert-Beer, utilizando a A260, com coeficiente de extinção molar de 6600 L mol-1. Para os estudos através da titulação fluorimétrica (espectrofluorímetro Shimadzu, modelo RF 5301), a concentração do composto foi mantinda constante (10 µmol L-1) e o DNA foi adicionando em quantidades crescentes, onde variou de 10 a 300 µmol L-1. Já nos ensaios de avaliação do modo de ligação com o ctDNA, foi empregado uma solução estoque de iodeto de potássio a 0,2 mol L- 1, e uma solução de brometo de etídio a 0,5 mmol L-1 com parâmetros instrumentais λex = 520 nm e λem = 598 nm.

Resultado e discussão

No Esquema 1.1 encontram-se as estruturas dos compostos avaliados. De forma geral, quando um ligante interage com o DNA formando um complexo, mudanças nos valores de absorvância e na posição da banda podem ocorrer por UV-vis, bem como também nas intensidades de emissão por fluorescência (JAMOUT; GARGALLO, 2012; SUN, et al, 2011). Com base nessa teoria foram observados nos estudos por fluorescência molecular, que os compostos 9c, 9e, 10b e 17a apresentaram redução na intensidade de emissão ao adiconar quantidades crescentes de DNA (Esquema 1.2), confirmando, portanto, a interação. É importante ressaltar que os espectros individuais, esquema 1 e figura 1, refere-se apenas ao composto 9c, pois este foi o mais ativo. Segundo Wang e colaboradores (2015), a tendência da diminuição na intensidade de fluorescência é demoniado quenching, e este pode ocorrer por vários mecanismos. A quantificação dessa interação pode ser efetuada através da constante Stern-Volmer (Ksv) (ALBANI, 2007) por meio da linearização do espectro, e a força da interação a partir da constante de ligação (Kb) (ZHAO, et al., 2014), que por sua vez variou de 1,204 a 118,7 x104 L mol-1 (Esquema 1.3), sendo o maior valor referente ao composto 9c, o qual se mostrou mais ativo frente às células cancerígenas de ovário resistente (NCI/ADR). A avaliação do tipo de quenching ocorrido indicou ser estático, pois o estudo por absorção no UV-visível mostrou que a interação ocorreu no estado fudamental, uma vez que o espectro da diferença entre o complexo DNA-ligante e o DNA livre não foi sobreponível (Esquema 1.4), sendo assim a variação de absorbância foi diferente de zero. Já o modo de ligação entre os derivados β-carbolínicos com ctDNA foi estudado avaliando o efeito de quenching do KI e a competição com brometo de etídio (BE) (REHMAN, et al., 2015; SARWAR, et al., 2015), sendo este último um bom intercalante ao DNA (SAVARIZ, et al.,2014). Pode-se observar, na Figura 1a e 1b, que o sinal analítico, assim como os valores de KSV (constante de quenching de Stern-Volmer) reduziram, respectivamente, para KI na presença de ctDNA indicando interação por intercalação. Dessa forma, o ligante fica protegido pelo DNA e, assim, não acessível aos íons iodeto. Para confirmação dos dados obtidos, o ensaio com o Brometo de etídeo (BE) mostrou que a intensidade de emissão do complexo BE-DNA diminuiu à medida que a concentração dos compostos aumentou, apresentando, portanto, um percentual de descréscimo variando na faixa de 64,3 a 79,9% (Figura 1c). Essa magnitute de descréscimo está relacionada à capacidade do composto em deslocar o BE do DNA (SILVA, et al., 2016), assim a ordem estabelece: 10b > 9e > 9c > 17a. Dessa forma, pode-se dizer que a interação dos compostos estudados e o ctDNA é via intercalação e o mecanismo de quenching é estático de acordo com Silva, et al. (2016). Além de que, os resultados obtidos pelo mesmo para Kb, os quais estão na faixa de 0,033 a 182 x 104 L mol-1, corroboram com os dados do presente trabalho.

Estudos de interação com ctDNA; 1)Estruturas dos compostos avaliados; 2)Titulação fluorimétrica; 3)Parâmetros de ligação; 4)Ensaios por UV-vis.


Avaliação do modo de ligação dos compostos β- carbolínicos com o ctDNA;a)Ensaio KI;b)Valores de KSV na ausência e presença do DNA;c)Competição com EB.

Conclusões

O presente estudo mostrou que os compostos analisados interagem com o ctDNA formando um complexo supramolecular e a constante dessa ligação variou de 1,204 a 118,7 x 104 L mol-1. O queching observado foi de natureza estática e o modo de ligação mostrou ser via intercalação, pois os ensaios do KI apresentou redução no sinal analítico quando este foi colocado na presença de ctDNA, e também porque houve descrécimo de emissão nos ensaios com o brometo de etídio, onde a variação ficou na faixa de 64,3 a 79,9%. Os dados obtidos estão de acordo com a literatura.

Agradecimentos

Referências

ALBANI, J.R. Principles and applications of fluorescence spectroscopy. Estados Unidos: Blackwell Publishing, 2007.
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