Síntese e determinação da concentração Mínima Inibitória (CMI) de derivados Tiazolo[3,4d] piridinas contra a bactéria Staphylococcus aureus (ATCC 29213)

Resumo

Nos últimos anos a necessidade de agentes antimicrobianos mais eficientes cresceu. Muitas moléculas vêm sendo elaboradas nas suas mais diversas complexidades estruturais, como as reações de Biginelli para a obtenção das 3,4-diidropirimidin-2(1H)-ona (DHPMs). As DHPMs possue diversas propriedades farmacológicas. Diferentes substratos metilênicos foram incorporados com sucesso a reação de Biginelli como por exemplo o núcleo da 2,4- tiazolidinadiona (TZD). O presente trabalho objetivou a síntese derivados de TZD acoplados a núcleos de DHPMs e submete-los a avaliação antimicrobiana determinação da concentração mínima inibitória (CMI): 5 compostos apresentam alta atividade antimicrobiana contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e 2 compostos apresentaram atividade moderada.

Palavras chaves

Biginelli; Tiazolidinadiona; antibacteriana

Introdução

Nas ultimas duas décadas o interesse em torno das propriedades químicas e biológicas das 3,4-diidropirimidin-2(1H)-ona (DHPMs) aumentou consideravelmente. O amplo espectro de funções biológicas que as DHPMs denotam tornam a síntese desses heterocíclicos versáteis na elaboração de compostos com potencial terapêutico. Essa reação permite a substituição do β-cetoéster por outros substratos metilenicos favorecendo a investigação de novas metodologias e assim tem permitido a descoberta de derivados de DHPMs com potencial farmacológico (SINGH et al., 2012). É bem reportado a versatilidade e a singularidade de protocolos de acoplamento da reação de Biginelli a outros núcleos tornando esta metodologia poderosa para a síntese de novas moléculas terapêuticas, como a inserção do núcleo da 2,4-tiazolidinadiona (TZD) a esta reação. Os derivados da TZD são já conhecidos por suas distintas propriedades ações farmacológicas como: propriedades anticonvulitárias, antibacterianas, antivirais e antidiabéticas, outros derivados com potencial antitumoral, anti-inflamatório e antibacteriano também são reportados na literatura (SANCHEZ et al., 2006). Vários métodos preliminares são utilizados para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica de compostos sintéticos. Um dos mais empregados é o ensaio para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), esse ensaio se baseia na avaliação da atividade antimicrobiana através da determinação de uma pequena quantidade de substancia capaz de inibir o crescimento do microrganismo teste, este valor é definido como Concentração Mínima Inibitória (CMI). Este ensaio se faz necessário tendo em vista a necessidade de novos agentes antimicrobianos em detrimento do surgimento de microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais, associadas a AIDS, quimioterapia antineoplásica e transplantes (Penna et al., 2001). A função primária na determinação da susceptibilidade de uma bactéria é proporcionar informações que possam ser usadas na escolha de uma terapia. O método de diluição se divide em duas metodologias: macro e micro diluição. Na macro diluição são necessárias grandes quantidades de volume de meio de cultura cerca de 1,0 a 10,0 mL, apresenta a como desvantagem um largo tempo na execução da técnica, gera grandes quantidades de resíduos, possibilitando pequeno número de réplicas em contrapartida o método de microdiluição utiliza microplacas com 96 poços, com volume de meio de cultura entre 0,1 e 0,2 mL (COLLINS, 1995). O método de microplacas é barato, tem reprodutibilidade, é 30 vezes mais sensível que outros métodos usados na literatura, requerem pequena quantidade de amostra, pode ser usado para grande número de amostras. Possibilita ainda a visualização da atividade inibitória dos compostos sintéticos mesmo frente as menores concentrações (BONA et al., 2014). Sendo o mesmo considerado melhor para determinar a atividade antimicrobiana, por fornecer dados quantitativos, para determinar a atividade antimicrobiana de substancias sintéticas (BONA et al., 2014). Diante do exposto o trabalho objetivou sintetizar e purificar derivados de TZD acoplados a núcleos de DHPMs e submete-los a avaliação antimicrobiana determinação da concentração mínima inibitória (CMI) dos mesmos contra bactérias Gram-positiva.

Material e métodos

Para a obtenção dos compostos de interesse inicialmente procedeu-se a otimização das condições reacionais, as quais foram: em balão de 25 mL de fundo redondo adaptado para refluxo foram adicionados 1,45 mmol de Imidazol, 2 equivalentes de TZD, 1 equivalentes de ureia\tiureia e aldeído, 1mLTHF, a mistura reacional foi mantida sob agitação constante durante o tempo de 2h a temperatura de 90ºC. Ao fim da reação os produtos formados recristalizados com etanol, após seco aferiu-se o ponto de fusão e posteriormente os compostos foram devidamente caracterizados por análises espectroscópicas: IV e RMN de 1H e 13C.Posteriormente os compostos sintetizados foram submetidos a ensaio antimicrobiano. Foram utilizadas cepas-padrão American Type Culture Collection (ATCC) mantidas nos Laboratórios de Microbiologia da Universidade Estadual de Goiás (UEG). O Micro-organismo teste utilizado na determinação da concentração mínima inibitória (CMI) foi A bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus (ATCC 29213). A leitura das microplacas foi realizada através da visualização da turvação antes de acrescentar a resazurina, após acrescentar a resazurina, onde a permanência da coloração azul indica ausência de micro-organismo e a mudança da coloração azul para rosa intenso indica presença de micro-organismo. O meio de cultura utilizado neste ensaio foi o caldo Muller Hinton (MH). Os compostos foram solubilizadas em Dimetilsulfóxido (DMSO) a 5% e diluídas em caldo MH de modo a obter uma concentração de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2 e 15,62 μg.mL-1. O antibiótico Cloranfenicol (Inlab) nas concentrações de 64, 32,16, 8, 4, 2, 1 μg.mL-1, foi utilizado como controle para validação de técnica. Os inóculos bacterianos foram preparados, a princípio, suspendendo-os em solução salina estéril (NaCl 0,9%) até obtenção de uma turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland, obtida por leitura em espectrofotômetro a 625 nm (79,4% a 83,2% de Transmitância). Em seguida, preparou-se uma diluição 1:10 em salina, de forma a obter uma concentração de células de 107 UFC.mL-1. Posteriormente, 5 μL do inóculo foram depositados em todos os orifícios da microplaca, exceto nos orifícios da linha G que serviram como controle da esterilidade do meio e das amostras. A diluição final dos inóculos nos orifícios ficou em torno de 5 x 105 UFC.mL-1 ou 5 X 104 UFC/orifício. As microplacas foram tampadas e mantidas em estufa à 35ºC por 22 horas. A solução estoque de resazurina à 0,1% foi preparada dissolvendo 10 mg de resazurina em 10 mL de solução fisiológica à 0,9%. Alíquotas foram retiradas para obtenção da solução à 0,00625%. Após o período de incubação das microplacas, foram adicionados 20µL de resazurina a 0,00625% em cada poço, de modo que a concentração da mesma em cada poço fosse de 0,001%.

Resultado e discussão

A reação procedeu conforme esquema 1. Após duas horas, foi realizada a leitura das microplacas em espectrofotômetro a 570 e 600nm e os devidos cálculos para determinação da porcentagem de inibição de cada composto foram realizados de acordo com as informações dispostas na bula da resazurina (GUDIÑA et al., 2010). Os cálculos realizados após a leitura permitiram determinar a CMI 50% de cada composto, a qual é apresentada na Tabela 1. Os resultados apresentados na tabela 1 demonstraram que a cepa Gram-positiva foi sensíveis aos compostos TZD 1, TZD 2, TZD 3, TZD 4, TZD 6 e percentual de inibição de 80, 65, 70, 65 e 80% respectivamente, com alta intensidade de inibição contra a cepa, uma vez que de acordo com a classificação de Holetz e colaboradores 2002, compostos que apresentarem valores de CMI até 100 µg.mL-1 apresentam promissora atividade antimicrobiana; já os compostos TZD 5 e TZD 7 (50 e 70% de inibição da cepa) apresentaram CMI entre 100 e 500 µg.mL-1 indicando atividade moderada (HOLETZ et al., 2002).

Esquema 1. Esquema reacional da 2,4-tiazolidinadiona via reação de Big

Tabela 1. Concentração mínima inibitória (CMI 50%) frente à Staphyloco

Conclusões

Os resultados obtidos no teste antimicrobiano indicaram que 5 dos compostos sintetizados apresentam atividade antimicrobiana contra a bactéria Gram- positiva Staphylococcus aureus (ATCC 29213), visto que a cepa se mostrou altamente sensível aos mesmos, sendo, portanto, potenciais agentes terapêuticos para o tratamento de patologias causadas por agentes microbianos. Outros 2 compostos apresentaram atividade antimicrobiana moderada. A metodologia empregada para a avaliação antimicrobiana dos compostos sintetizados a partir de micro diluição em microplacas mostrou-se sensível e de boa reprodutibilidade.

Agradecimentos

bolsa CAPES - FAPEG, CNPq, UEG, Bolsa BIP e Pró-projeto pesquisa edital 026/2016.

Referências

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