Análise in vitro da citotoxicidade de líquidos iônicos próticos em células humanas

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Química Verde

Autores

Andrade, R.S. (UNIFACS) ; Zanoni, B. (UNIARA) ; Chiari-andréo, B.G. (UNIARA) ; Trovatti, E. (UNIARA) ; Iglesias, M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA)

Resumo

Os líquidos iônicos próticos (LIP) tem sido investigados nos últimos anos devido às suas aplicações potenciais, geralmente com o objetivo de substituir solventes orgânicos tóxicos tradicionalmente utilizados. Estas substâncias são consideradas “verdes” devido à sua quase nula volatilidade, alta estabilidade térmica e segurança ambiental. No campo biológico, até o momento não foram estudados seus impactos. Visando montar um mapa de propriedades dos LIP, neste trabalho o seu efeito citotoxicológico foi avaliado in vitro usando células humanas HepG2 e HaCat. Os resultados de testes de citotoxicidade revelaram valores de IC50 inferiores quando comparados com líquidos iônicos derivados de imidazólio, o que representa um ponto de partida para sua aplicação em processos e produtos de uso humano.

Palavras chaves

Líquidos Iônicos Próticos; Citotoxicidade; Células humanas

Introdução

Líquidos Iônicos (LI) tem tido especial relevância nos últimos anos em virtude das suas propriedades e aplicações potenciais como substitutos de solventes químicos tradicionalmente utilizados. Estas substâncias são sais orgânicos não voláteis, o que impede a dispersão por evaporação e, consequentemente, a poluição da atmosfera. Embora nos últimos anos o esforço de pesquisa tenha sido importante, quase tudo foi orientado para Líquidos Iônicos Apróticos (LIA) (famílias de cátion Imidazólio, Piridínio etc), de alto custo, escassa disponibilidade comercial e alta toxicidade na água e no solo (microbiota e substrato vegetal). Neste trabalho foi sintetizada e estudada uma nova família de Liquidos Iônicos de natureza Prótica (LIP) (também conhecida como sais de Bronsted), com funcionalidade provada nos últimos anos em diversas áreas industriais, de baixo custo e total biodegradabilidade no ambiente, sendo os produtos de decomposição nutrientes utilizáveis por microrganismos e plantas (Plechkova e Seddon, 2008; Greaves e Drummond, 2008; Feng et al, 2010;. Hallett e Welton, 2011; Khashavar de 2014, Hajipour e Rafiee de 2015, Jenkins et al., 2016). Os LIP são sais baseados em aminas substituídas como cátions e ácidos orgânicos desprotonados com diferentes números de átomos de carbono como ânions (Cota et ai, 2007;. Iglesias et al, 2008; Alvarez et al, 2010 ab; Iglesias et al, 2010; Henderson et al, 2012; Greaves et al, 2015). O principal mérito deste tipo de composto é a obtenção de impedimento estérico suficiente com um número reduzido de átomos sem estruturas complexas ou grupos moleculares de risco potencial (halogênios, heterociclos etc). Ao contrário dos líquidos iônicos apróticos, predominantemente hidrofóbicos, muitos dos líquidos iônicos próticos são solúveis em água, e ainda que sejam “amigos do ambiente” (Peric et al, 2011, Peric et al, 2013; Peric et al, 2014; Peric et al., 2015), podem representar um perigo potencial se em contato com as células humanas devido ao teor de água nestes meios. Informação sobre a toxicidade humana é fundamental para aplicar líquidos iônicos como solventes de novos processos, o que sugere a necessidade de aumentar o esforço de investigação nesta área. A toxicidade é o resultado de várias características associadas dos reagentes químicos que compõem os produtos. Algumas propriedades dos reagentes químicos que interferem na toxicidade dos LI são, por exemplo, o comprimento da cadeia alifática e a natureza química das suas moléculas. Centenas de LI têm sido sintetizados e testados quanto ao seu efeito tóxico, principalmente no que diz respeito à sua toxicidade sobre o ambiente. No entanto, uma avaliação completa da segurança destes novos compostos tem de seguir uma sequência de ensaios in vitro e in vivo, conforme normas regulamentadoras vigentes no Brasil e no mundo. A cultura de células in vitro tem sido utilizadas com sucesso em ensaios pré-clínicos a fim de determinar a toxicidade de produtos químicos. Os testes de citotoxicidade in vitro permitem estudar o comportamento de células em um micro-ambiente controlado usando tipos adequados de cultivos para cada produto específico. Neste trabalho, treze LIP (Tabela 1) desenhados para apresentar baixo efeito tóxico foram testados em células humanas, nomeadamente nos queratinócitos e hepatócitos, com o objetivo de determinar o seu efeito citotóxico na tentativa de avaliar o seu potencial em aplicações relacionadas com o uso em seres humanos e animais.

Material e métodos

Preparação dos LIP Mono ou dietanolamina de teor maior que 98,0% foi colocada num balão de três bocas equipado com um condensador de refluxo, um sensor de temperatura PT- 100 para controlar a temperatura e um funil de gotejamento. O balão foi montado em um banho de gelo. O ácido orgânico (> 98,0%) foi adicionado gota a gota ao balão sob agitação com uma barra magnética. A agitação foi continuada durante 24 h à temperatura ambiente, a fim de se obter um líquido amarelo viscoso final. Em cada caso, após a síntese, os espectros de 1H RMN e de FT-IR foram realizados de forma a caracterizar o produto de síntese e para confirmar a sua estrutura iônica. O procedimento de síntese completo é descrito em trabalhos anteriores (Alvarez et al., 2010 a-b). Linhagem celular HepG2 (linhagem celular humana - hepatócitos) e HaCat (linhagem celular humana - queratinócitos) foram usadas para os testes. Avaliação da toxicidade da IL em células O efeito citotóxico do LIP foi avaliado pelo método de ensaio de MTT, utilizando células hepatócitas humanas HepG2 e as células de queratinócitos humanos (HaCaT) (Chiari et al., 2012). As células foram cultivadas separadamente em Meio Essencial Mínimo (MEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (penicilina 100 U/mL; estreptomicina 0,1 mg/mL). As culturas foram mantidas a 37 ± 2◦ C em 5% de atmosfera de CO2. As células em confluência de 80-90% foram tripsinizadas, centrifugadas durante 3 minutos a 1200 rpm, e transferidos para uma placa de 96 poços. O MEM com soro fetal bovino foi utilizado para neutralizar a tripsina. A densidade de células utilizada para a análise de citotoxicidade foi de 1 × 106 células/ml. As placas de 96 poços foram incubadas durante 24 h para a completa adesão de células ao prato. Depois, as células foram tratadas com 100 uL de controle positivo (10% de dimetilsulfóxido), controle negativo (MEM) e diferentes concentrações de LIP (0,16, 0,31, 0,63, 1,25, 2,50 e 5,00%). Após 24 h, o meio foi removido e as placas foram suavemente lavadas com solução salina tamponada com fosfato. 100 uL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio - MTT (1 mg / mL em PBS) foi adicionado a cada poço. As microplacas foram incubadas a 37 ± 2◦ C durante 4 h, protegida da luz, para permitir o crescimento de cristais violeta de formazano). A solubilização dos cristais de formazano foi efetuada pela adição de 100 uL de álcool isopropílico para cada poço. A absorvância foi lida a 595 nm em um espectrofotómetro Bio-rad modelo 550. Os testes de citotoxicidade foram realizados em pelo menos três ensaios independentes, e, para cada um, o tratamento foi realizado em triplicata. A percentagem de células mortas e vivas foi calculada em relação ao controle negativo e representa a citotoxicidade de cada tratamento, tal como proposto por Zhang et al. (2004), como se segue: % de viabilidade celular = [(ABS de controle negativo - ABS de amostras tratadas com LIP) / (ABS de controle)

Resultado e discussão

As linhagens de células utilizadas neste estudo foram escolhidas para testar a citotoxicidade de LIP quando em contato com a pele (por contato direto) e fígado (se for absorvido). HaCat são células humanas queratinócitos imortalizados capazes de se diferenciar em epiderme (Boukamp et al, 1988). Eles são usados para testar a citotoxicidade de produtos que entram em contato com a pele, uma vez que são encontrados em organismos vivos na camada externa da pele, a epiderme. HepG2 são células de fígado humano metabolicamente ativas. Estas células são amplamente utilizadas para estudar o efeito citotóxico dos agentes que são capazes de chegar ao fígado. Quando exposta a estímulos, HepG2 simula a resposta de um organismo vivo. Esta linhagem foi usada para estudar a citotoxicidade do LIP com a finalidade de detectar qualquer dano para as células do fígado. 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) de teste foi utilizado para estudar o comportamento das células na presença de LIP para determinar o IC50, isto é, a concentração de LIP necessária para inibir o crescimento de 50% das céluas (Chiari et al, 2014). Os resultados de citotoxicidade para a concentração mais elevada testada, 50% em peso, evidenciam a característica mais importante dos PIL, isto é, a sua capacidade de dissociação na presença de água, o que aumenta a força iônica do meio. A Figura 1 mostra a morfologia das células HepG2 expostas a 50% em peso de 2-HDEACi (amostra 12). No início do tempo de exposição (0 h, Fig. 1A), foi possível observar a morfologia da célula, com a membrana celular intacta. Após 10 h de exposição a mesma célula mostrou a membrana completamente rompida, como pode ser visto na Fig. 1B. O resultado indicou a alta força osmótica da solução fora das células, levando-as a plasmólise e resultando em inibição total do seu crescimento. O meio hipertônico causou o transporte osmótico de água de dentro para fora da célula. O mecanismo de inibição pode ser comparado com outras substâncias iônicas. O exemplo clássico é uma solução de NaCl que, a 0,9% em peso é confortável para a pele e seguro para as células. No entanto, a cerca de 3% em peso, inibe totalmente o crescimento celular.O efeito de inibição do crescimento foi detectado para todos os LIP a 50% em peso. Os resultados do MTT, utilizando 50% em peso de LIP foram úteis para elucidar o mecanismo de morte para os LIP testados em concentrações elevadas. Assim, os seguintes ensaios foram realizados com concentrações mais baixas e a sua IC50 (mM) para HepG2 e HaCat é mostrada na Tabela 1. A toxicidade dos produtos químicos depende da sua permeação e mecanismo de ação (interação com os organelos celulares), que estão estritamente relacionadas com a estrutura química. Assim, para correlacionar a estrutura química dos LIP com a sua atividade, alguns detalhes importantes têm de ser considerados, tais como a toxicidade do cátion/ânion que compõe o LIP e a característica hidrófila/hidrófoba (coeficiente de partição) da molécula. Em geral, os resultados mostraram maior efeito citotóxico sobre a linhagem de células HepG2 quando em comparação com seu efeito sobre HaCat. A concentração dos LIP 1, 2, 7, 9, 10 e 12 para destruir as células HaCat foi o dobro do que a concentração necessária para destruir as HepG2. Para as amostras 8 e 11, o efeito foi mais pronunciado, e a concentração necessária para alcançar a IC50 foi oito vezes superior. O maior efeito dos LIP em HepG2 pode ser eventualmente atribuído à capacidade metabólica das células, o que poderia gerar metabolitos de LIP, e tais metabolitos podem ser mais eficazes do que os próprios LIP em termos de inibição do crescimento. Os LIP mais citotóxicos foram as amostras 9 e 10, à base de ácido cítrico e dietanolamina (amostra 10) ou monoetanolamina (amostra 9). O ácido cítrico é um ácido tri-carboxílico com três cargas negativas, o que requer três contra íons para a preparação do LIP correspondente. Supondo que as amostras 9 e 10 não penetram as células (Akeson e Munns, 1989), sua dissociação gera seis cargas livres no meio externo, o que pode desestabilizar as membranas celulares que levam à inibição do crescimento. O efeito também pode ser correlacionado com a maior polaridade das amostras, diminuindo a sua taxa de penetração na membrana, reduzindo assim a toxicidade. Observou-se o efeito do comprimento da cadeia alquílica comparando os resultados de citotoxicidade de amostras 8 e 7 (ácido adípico, seis C na cadeia alquil) com as amostras 1, 3 e 5 (ácidos carboxílicos) relativamente curtos. As cadeias alquil longas de ácido adípico com a cabeça polar em amostras 8 e 7 foi capaz de se incorporar à bicamada lipídica da membrana celular e desestabilizá-la, levando a ruptura da membrana, matando as células. Altas concentrações de amostras 1, 3 e 5 foram necessárias para alcançar efeito semelhante. O efeito citotóxico dos líquidos iônicos de cadeia longa foi já descrito, principalmente, para os cátions de LI (Wang et al, 1991). As amostras 1, 2, 3 e 5 são LIP de cadeias muito curtas, compostas de pequenos ácidos carboxílicos e a o cátion monoetanolamina. Os testes de citotoxicidade revelaram o seu menor efeito tóxico, possivelmente devido à sua composição química. Mesmo que seu baixo volume facilite a entrada dos LIP nas células, o recurso atóxico dos seus componentes requer concentrações elevadas para inibir o crescimento. No que diz respeito à toxicidade das moléculas utilizadas aqui, eles foram escolhidas de modo a resultar em baixo efeito tóxico. O contra-cátion das moléculas foi monoetanolamina ou dietanolamina. A estrutura química de monoetanolamina é muito semelhante ao de colina. A colina é uma molécula funcional presente em quase todos os tipos de organismos vivos, por conseguinte, completamente atóxica e permeável à membrana da célula. A monoetanolamina e dietanolamina também são moléculas de baixo efeito tóxico. Com respeito à contraparte aniônica do LIP, quase todos eles, por exemplo, citrato, lactato e propionato, são normalmente sintetizados e metabolizados no corpo do animal. Outros, tais como formiato, salicilato, maleato, adipato e benzoato podem também ser metabolizada por humanos e animais. Finalmente, a citotoxicidade dos LIP aqui preparados e avaliados utilizando testes MTT revelaram valores de IC50 inferiores quando comparados com líquidos iônicos derivados de imidazólio (Wang et al, 1991). Estes LIP podem ser considerados seguros como solventes ou aditivos na preparação de produtos para aplicação humana, ambiental e animal, totalmente de acordo com as previsões baseadas na sua estrutura química.

Imagens da célula HEpG2 no tempo 0 h (A) e depois de 10 h (B) de exposição ao 2-HDEACi


Tabela 1. IC50 para os LIPs testados

Conclusões

Os resultados dos ensaios citotóxicos in vitro mostraram que os LIP utilizados em concentração elevada são capazes de perturbar as membranas das células HepG2 e HaCat por pressão osmótica. O baixo efeito citotóxico dos LIP testados foi observado em células HepG2 e HaCat humanas, com o IC50 variando entre 13 e 200 mM. Estes resultados são devidos à estrutura química dos LIP, concebidos para apresentar baixos efeitos tóxicos.

Agradecimentos

À FAPESB (Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado da Bahia), à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior) e à UNIFACS, pelo apoio a pesquisa

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