DETERMINAÇÃO DE PUREZA E AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DA B-LAPACHONA EM MODELO DE SEPSE.

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Produtos Naturais

Autores

Oliveira, A.L.B. (UFPA) ; Navegantes, K.C. (UFPA) ; Gomes, R.S. (UFPA) ; Pontes, A.C.A.A. (UFPA) ; Monteiro, V.V.S. (UFPA) ; Reis, J.F. (UFPA) ; Pegado, W.A. (UFPA) ; Oliveira, A.B. (UFPA) ; Monteiro, M.C. (UFPA)

Resumo

β-lapachona é uma orto-naftoquinona isômero do lapachol isolada a partir da casca de Tabebuia avellanedae. Seu grau de pureza e o efeito imunomodulador em modelo de sepse foram investigados. A análise de pureza foi realizada por meio da cromatografia líquida de alta eficiência. Em seguida a migração leucocitária, expressão de óxido nítrico (NO) e sobrevida foram analisadas em modelo murino de sepse. O composto apresentou alta qualidade de pureza. Além disso, os animais sépticos pré-tratados com β-lapachona tiveram uma redução de neutrófilos, aumento de mononucleares no foco infeccioso, supressão de NO e aumento da sobrevida em relação ao grupo não tratado. Assim, comprovou-se a pureza e o efeito imunomodulador do composto, alterando os parâmetros que contribuem para progressão da sepse.

Palavras chaves

CLAE; β-lapachona; Sepse

Introdução

β-lapachona, uma orto-naftoquinona isômero do lapachol, substância de ocorrência natural isolada do ipê roxo (Tabebuia avellanedae) da família Bignoniaceae, na qual o extrato é medicinalmente utilizado há séculos. Apresenta várias atividades farmacológicas, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, tripanossomicida, antitumoral e atividade anti- inflamatória atribuída em parte a imunomodulação (Lourenço et al, 2011; Guiraud et al, 1994; Salas et al, 2008; Yu et al, 2014; Sitônio et al,2012). A atividade anti-inflamatório do composto químico é de grande interesse para a indústria farmacêutica. Nos últimos anos, a sepse constitui a segunda principal causa de morte em unidade de terapia intensiva (UTI) e é caracterizada por um processo infeccioso com acentuada liberação de mediadores inflamatórios. Desta forma, há necessidade de novas terapias menos tóxicas e eficazes, como as provenientes de produtos naturais com propriedades anti-inflamatórias e antimicrobianas, como a β-lapachona. Com isso, este trabalho teve por objetivo determinar a pureza de β-lapachona para torna-la adequada nos estudos in vivo, e assim avaliar de parâmetros inflamatórios e oxidativos em modelo murino de sepse.

Material e métodos

Avaliação de pureza: A β-lapachona teve seu grau de pureza obtido por análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diôdos (CLAE-DAD). Pesou-se 1 mg da amostra que foi dissolvida em 1 mL de metanol. A amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 min e o sobrenadante analisado por CLAE-Fase reversa. No cromatográfo, 2,0 μL da amostra foi injetada, a eluição foi em gradiente com água ultrapura + 0,1% ácido fosfórico/acetonitrila, compreendendo um período de eluição linear (5 – 95% ACN de 0 a 40 min), em seguida, um curto período de eluição isocrática (95% ACN de 40 a 45 min), retornando a condição de eluição inicial 45 a 50 min (5% ACN). A leitura foi feita em detector arranjo de diôdos, nos comprimentos de onda na faixa de 220-400 nm. Procedimentos experimentais: A β-lapachona (50mg/kg) foi utilizada no pré-tratamento intraperitoneal de animais submetidos ao modelo de sepse denominado transfixação do coto-cecal (CLP). Após 24 horas os animais foram sacrificados para avaliação de parâmetros como: migração leucocitária através da contagem total em câmara de Neubauer e diferencial corado pelo método de May Grunwald Giemsa, NO pela reação de Griess e sobrevida em 16 dias. O mesmo ocorreu com grupos de animais que não receberam pré-tratamento (sham), grupo pré-tratado com ceftriaxona 20mg/kg e grupo pré-tratados com solução salina denominado grupo CLP. Todos experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê de Ética animal. Análise estatística Os dados foram avaliados pela Análise de Variância (ANOVA) de uma via, com correção pelo teste de Tukey. Os dados de cada grupo experimental foram expressos como a média ± erro padrão da média (e.p.m.). A probabilidade aceita como indicativa da existência de diferenças significantes será de p<0,05

Resultado e discussão

A partir da avaliação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência não se observa indício de lapachol ou α-lapachona (isômero de β-lapachona) sugerindo um bom grau de pureza dos cristais do composto. No cromatograma da Figura 1 observa-se apenas o pico relativo característico da β-lapachona, com área de 100% e tempo de retenção de 27,4 minutos. No espectro no UV obtido online (Figura 1) observaram-se as bandas de absorção com máximos de absorção (lmax) de 212,0, 256,8 e 290,0 nm, características da β-lapachona, conforme literatura (Cunha-Filho et al, 2007) Alem disso, β -Lapachona se mostrou como moduladora de leucócitos durante a sepse. A figura 2A evidencia que após 24 horas ocorre redução de neutrófilos. Estudos anteriores relatam que a depleção de neutrófilos após início da sepse melhora a sobrevida após CLP e reduz as concentrações de citocinas pró-inflamatória (Bosmann e Ward, 2013). Quanto aos mononucleares, o pré-tratamento com β-lapachona induziu o influxo destas células 24 horas após a sepse, quando comparado ao grupo CLP (Figura 2B). Dentre as células mononucleares os macrófagos fenótipo M1 atuam na remoção de bactérias nas fases iniciais da sepse (Murray e Wynn, 2011). A figura 2 (C e D) mostra que o pré-tratamento com β-lapachona inibiu a produção de oxido nítrico induzido pela sepse após 24 horas nas amostras de soro e lavado peritoneal. Dados da literatura indicam que NO funciona como mediador-chave em alterações pulmonares, renais e cardíacas da sepse. Sendo observado que o uso de inibidores da NOS atenuam vários sintomas desta síndrome (Cauwels, 2007). Os dados anteriores refletiram no aumento da sobrevida dos animais pré-tratados como composto. O grupo CLP foi a óbito no 5º dia, enquanto os animais β-lapachona sobreviveram pelo menos até 16 dias.

Figura 1. Cromatograma obtido por CLAE-DAD, a 350 nm, e espectro no UV da β-lapachona


Figura 2. Migração leucocitária (A e B). Número de neutrófilos e mononucleares no lavado peritoneal. Concentração de NO (C e D) em animais com sepse.

Conclusões

Conclui-se que a β-lapachona utilizado neste estudo se apresentou com alta qualidade de pureza comprovada através da CLAE. Além disso, o pré-tratamento em modelo de sepse por CLP demostrou ação imunomoduladora através da redução de neutrófilos e aumento de mononucleares para o foco infeccioso, assim como inibiu NO induzidos pela sepse, resultando no aumento da sobrevida dos animais. Desta forma, estes efeitos benéficos em modelos animais de sepse, sugerem a possibilidade da β-lapachona por ser usada como uma potencial modalidade terapêutica em sepse.

Agradecimentos

Aos órgãos de fomento CAPES e CNPq e a Liga Acadêmica de Imunologia, Microbiologia e Estresse Oxidativo da UFPA pelo apoio financeiro.

Referências

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