Determinação de variáveis com efeitos importantes na separação de metabólitos secundários de Cynara scolymus (“alcachofra”) por CLAE-DAD, utilizando conceitos de química verde

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Produtos Naturais

Autores

Souza, O.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - CAMPUS BAURU) ; Rinaldo, D. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - CAMPUS BAURU) ; Funari, C.S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - CAMPUS BOTUCATU) ; Carneiro, R.L. (UFSCAR - CAMPUS SÃO CARLOS)

Resumo

A crescente preocupação com o meio ambiente impulsiona pesquisadores e instituições a desenvolverem novas estratégias que visem o desenvolvimento econômico e científico do planeta de modo que diminua os efeitos drásticos acarretados desde a Revolução Industrial. No âmbito de análises de plantas medicinais, o grande impacto está nos resíduos gerados pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com uso de solventes e modificadores tóxicos. Diante desse contexto, esse projeto determinou, aplicando quimiometria, os fatores cromatográficos de maior importância na separação dos metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico das folhas de Cynara scolymus (“alcachofra”), utilizando CLAE com água e etanol, um solvente não tóxico e sustentável.

Palavras chaves

Cynara scolymus; cromatografia verde; quimiometria

Introdução

Em 2009, o Ministério da Saúde do Brasil elaborou a Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS (Renisus), a qual contém 71 espécies vegetais com potencial farmacológico para orientar pesquisas que resultem em fitoterápicos de baixo custo à população(BIBLIOTECA VIRTUAL EM SAÚDE,2009). Uma dessas espécies é a alcachofra, ou Cynara scolymus L., planta usada na medicina popular no tratamento de males gástricos, renais e hepatobiliares e hipertensão,além de ser antioxidante e anti-inflamatória(COSTA et al,2009,NEGRO et al,2012,SCHUTZ et al,2004,TESKE;TRENTINI,1995).Nos estudos envolvendo alcachofra,usa-se com frequência a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e a acetonitrila(ACN) destaca-se como solvente, ainda que seja altamente tóxica para os experimentadores e gere resíduos que potencializam os impactos ambientais(CASSINI,ANTUNES,KELLER,2013).Com a fabricação do fitoterápico de C. Scolymus, análises de controle de qualidade podem gerar grandes quantidades desse resíduos e provocar sérios danos à saúde dos analistas expostos a atmosfera de ACN. Desse modo, seria pertinente desenvolver metodologias de análise para essa espécie que reduzam ao máximo o consumo de ACN ou substituam por solventes não tóxicos como o etanol (EtOH), por exemplo. Uma estratégia rápida e racional para o desenvolvimento de métodos cromatográficos é a utilização da quimiometria para determinar variáveis cromatográficas da CLAE que possuem efeitos significativos na separação dos compostos presentes nas folhas de C. Scolymus. Este trabalho teve como objetivo determinar quais fatores cromatográficos possuem efeitos significativos na separação dos metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico das folhas de C.scolymus,aplicando o planejamento fatorial fracionário.

Material e métodos

As folhas moídas de C. scolymus foram cedidas pela empresa Centroflora Extratos Vegetais (Lote: 200112.122), sediada na cidade de Botucatu-SP. Uma quantidade de aproximadamente 10,00 g do material vegetal foi macerado com 100,0 mL da mistura EtOH/água (7:3, v/v) durante 144 horas. A mistura extratora foi substituída a cada 48 horas. Após a extração, a solução foi colocada em um evaporador rotativo, da marca Buchi, sob pressão reduzida, em temperatura de 50 ºC para eliminação dos solventes, resultando no extrato hidroalcoólico das folhas de C. scolymus. O extrato foi transferido para um vidro tarado e deixado em de banho aquecido, da marca Marconi, a 45°C até completa eliminação de água, resultando em 2,8487 g de massa. O extrato foi armazenado na geladeira a -8 °C para posteriores análises.As amostras foram preparadas por clean-up, em que uma massa de 20 mg do extrato foi solubilizada em 1 mL da EtOH/água (7:3, v/v) e aplicada em cartucho Sep-Pack C18 (Strata-E, 500 mg/3mL, Phenomenex), previamente ativado com 6 mL de EtOH e equilibrado com 6 mL EtOH/água (7:3, v/v). Em seguida, a amostra no cartucho foi eluída com 6 mL de EtOH/água 7:3. A fração obtida foi filtrada em microfiltro de PTFE (0,45 µm) e 20 µL foram analisadas por CLAE-DAD (Jasco®, bomba PU 2089 plus, detector DAD MD 2010 plus, injetor automático AS 2055 plus) com coluna de fase reversa XBridge (Waters, 150x4,6 mm, 5 μm) e pré-coluna (4x3 mm, 5μm). Foi realizada a triagem de variáveis utilizando planejamento fatorial fracionário com dois níveis e cinco fatores (Tab. 1a) e para os cálculos dos contrates foi utilizado o software livre de estatística Octave®.Visando utilizar a menor quantidade possível de energia (química verde), foi estipulado o tempo de análise de 30 min para todos os experimentos.

Resultado e discussão

Duas respostas foram avaliadas: (1) o número total de picos no cromatograma e (2) a distribuição dos mesmos ao longo do cromatograma (Green Chromatographic Factor Response – GCFR, desenvolvido pelo nosso grupo,FUNARI et al,2014). As duas respostas obtidas na triagem foram utilizadas para calcular os efeitos de cada fator estudado e suas combinações (Tab. 1b). Como é possível observar no gráfico normal da resposta número de picos (Fig. 1a), os contrastes que apresentaram efeitos significativos foram os dos fatores X1, X3 e X4. No gráfico normal da resposta GCFR (Fig. 1b), os contrastes que apresentaram efeitos significativos foram os dos fatores X1, X4 e X12. Em ambas respostas, os fatores X1 e X4 foram significativos na separação dos metabólitos. A % inicial de EtOH (X1) interferiu diretamente na força de eluição da fase móvel e o ácido presente no solvente pode ter provocado supressão de ionização dos metabólitos de caráter ácido e, portanto, melhorou a resolução dos picos. O fator Temperatura (X3) foi significativo apenas para a resposta número de picos. Em teoria, era esperado que os maiores níveis de X3 seriam melhores, pois afinariam os picos e aumentariam a eficiência (difusão mais rápida dos analitos, com estabelecimento de um prato teórico mais rapidamente). Porém, a alta temperatura forçou a eluição prematura de alguns compostos, deslocando a maior parte para a primeira metade do cromatograma, prejudicando assim distribuição no cromatograma. Por fim, o fator X12, referente a interação entre os fatores X1 e X2 (% final de EtOH), apresentou efeito significativo apenas para a resposta GCFR. Em teoria, uma menor taxa de variação do EtOH melhora a separação entre os compostos, melhorando a distribuição dos picos ao longo do cromatograma.

(a) Fatores e níveis investigados na triagem de C. scolymus e (b) Resultados do planejamento fatorial para duas respostas (No. picos e GCFR)


Gráfico normal de valores dos efeitos calculados para a resposta (a) No. picos e (b) GCFR

Conclusões

Foi possível observar que, dos cinco fatores cromatográficos avaliados para a CLAE com água e EtOH, quatro apresentaram efeitos significativos para duas respostas diferentes: a % inicial de EtOH, % final de EtOH, % ácido acético na água e Temperatura. O fator vazão da fase móvel (X5) não apresentou interferência na separação dos metabólitos. Portanto, os resultados deste trabalho podem auxiliar no desenvolvimento de método, ambientalmente amigável e sustentável, para aplicação da CLAE em análises de extratos polares de C. scolymus, utilizando água e EtOH como fase móvel.

Agradecimentos

À FAPESP, CNPq e à Prope-UNESP pelo auxílio financeiro concedido, à Centroflora Extratos pelo material vegetal e ao Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes da FC- UNESP.

Referências

BIBLIOTECA VIRTUAL EM SAÚDE. MS elabora Relação de Plantas Medicinais de interesse ao SUS. Brasília: Agência Saúde, 2009. Disponível em:
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/sus/pdf/marco/ms_relacao_plantas_medicinais_sus_0603.pdf>.

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COSTA, R.S., OZELA, E. F.; BARBOSA, W. L. R.; PEREIRA, N. L.; SILVA, J.A.C.Caracterização física, química e físico-química do extrato seco por nebulização (spray-drying) de Cynara scolymus L. (Asteraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.90,n.3, p. 169-174,2009.

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TESKE M., TRENTINI A. M. Herbarium: compêndio de fitoterapia. Ed. Herbarium Laboratório Botânico, Curitiba, Paraná. 1995.