Fatores cromatográficos que influenciam significativamente na separação dos metabólitos secundários de Phyllanthus niruri ("quebra-pedra") por CLAE utilizando etanol e água como fase móvel

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Produtos Naturais

Autores

Pelissari, J.H. (FACULDADE DE CIENCIAS - UNESP BAURU) ; Funari, C.S. (FACULDADE DE CIENCIAS AGRONOMICAS - UNESP BOTUCATU) ; Carneiro, R.L. (UNIVERSIDADE FEERAL DE SÃO CALOS) ; Rinaldo, D. (FACULDADE DE CIENCIAS - UNESP BAURU)

Resumo

Pesquisadores vem estudando práticas para diminuição da produção de resíduos tóxicos a fim de proteger o meio ambiente. Ao mesmo tempo, a produção de fitoterápicos vem ganhando a confiança da população no tratamento e cura de enfermidades. Porém, a maioria dos trabalhos de investigações fitoquímicas relata a aplicação da CLAE utilizando solventes tóxicos que prejudicam a saúde do analista gerando resíduos que necessitam de tratamento de alto custo. Portanto, este trabalho determinou, por planejamento fatorial, que a temperatura e % inicial de etanol são os dois fatores cromatográficos, de cinco avaliados, que influenciam significativamente na separação dos compostos das folhas de quebra-pedra por CLAE, utilizando etanol e água, solventes não-tóxicos, como fase móvel.

Palavras chaves

Phyllanthus niruri; Cromatografia verde; Quimiometria

Introdução

A espécie Phyllanthus niruri, também chamada de “quebra-pedra”, é uma planta pertencente à família Euphorbiaceae. Na medicina popular é utilizada, especialmente, para eliminação de cálculos renais.(SPRENGER, 2011; ALBRECHT, 2014). Estudos farmacológicos das partes aéreas de P. niruri indicaram desde ação anti-inflamatória até ação antilitogênica (COLOMBO et al., 2008). "Quebra-pedra" é uma das 71 espécies de interesse do SUS, o que evidencia seu potencial para produção de fitoterápico. Diversos estudos químicos e farmacológicos relatam o perfil cromatográfico de P. niruri por CLAE, porém, nesses estudos são utilizados solventes tóxicos prejudiciais à saúde do analista, como por exemplo metanol e acetonitrila, que também produzem resíduos que necessitam de um tratamento de alto custo para não causar danos ao meio ambiente. Levando em consideração o potencial da “quebra-pedra” para produção de fitoterápico, a quantidade de resíduos gerada em possíveis controle de qualidade, por exemplo, pode proporcionar sérios danos ao ambiente e à saúde dos analistas. Uma das alternativas que amenizam essa agressão ambiental é a aplicação de técnicas cromatográficas que utilizam solventes ambientalmente amigáveis, a chamada cromatografia verde. Devido a esses fatos, o trabalho teve como objetivo avaliar a influência de fatores cromatográficos experimentais na separação dos constituintes químicos da decocção das folhas de P. niruri por CLAE-DAD, utilizando como fase móvel H₂O e etanol (EtOH), solvente biodegradável e sustentável.

Material e métodos

As partes aéreas de P. niruri foram moídas e o pó foi submetido a decocção [1g do pó foi imerso em 10 mL de H₂O a 80ºC (proporção 1:10 de material vegetal/solvente extrator)]. Em seguida a decocção foi filtrada com papel-filtro, algodão hidrofílico e por último em microfiltros com poros de 0,45 μm (PTFE, Alcrom^®). Alíquotas de 20 μL foram injetadas no sistema CLAE. As análises por CLAE foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Jasco (bomba PU-2089 Plus, amostrador AS-2055 Plus, forno de coluna CO-2060 Plus) equipado com um detector de arranjo de fotodiodos (DAD, Jasco MD-2015 Plus), pertencente ao Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Ciências da UNESP de Bauru, sob responsabilidade do Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes. Foi utilizado uma coluna analítica de fase reversa XBrigde (150 x 4,6 mm d.i., 5μm) e uma pré-coluna de fase reversa Phenomenex^® (4 x 3 mm, 5μm). Para a triagem de variáveis, foi realizado um planejamento de meio fatorial utilizando 2 níveis (+1 e -1) com 5 fatores (variáveis) sendo eles: porcentagem inicial de EtOH na fase móvel, tempo de análise, temperatura de análise, porcentagem de ácido acético em água e vazão da fase móvel (mL.min^-1, Tabela 1).

Resultado e discussão

Para a determinação da influência dos fatores cromatográficos foi realizado uma triagem de variáveis por um Design Experimental, utilizando planejamento de metade de um fatorial de 2 níveis e 5 fatores (2v^5-1). Os níveis de cada fator foram determinados pela polaridade e comportamento dos constituintes presentes na decocção após análise por CLAE em fase reversa, com gradiente exploratório [5:95 a 100:0, EtOH:H₂O, v/v, em 30 min, 35°C, (Tabela 1)]. As respostas utilizadas para determinação da interferência dos fatores avaliados foram: número de picos, capacidade de picos da amostra e a função-resposta GCFR, (Green Chromatographic Fingerprint Response, desenvolvida pelo nosso grupo, FUNARI et al., 2014). Após as análises foi observado que as variáveis X1 e X3 apresentaram efeitos que se distanciaram significativamente dos efeitos dos demais fatores (Figura 1). Essa distinção não significa que os demais fatores cromatográficos (X2,X4 e X5) sejam descartáveis, mas sim que a variação dos mesmos interferem com menor magnitude na separação dos constituintes químicos da decocção das folhas de P. niruri, quando utiliza-se misturas de EtOH e H₂O como fase móvel. Com isso, o nível desses três fatores pode ser estabelecido de maneira que as análises sejam realizadas em um menor tempo e com menor consumo de solventes, convergindo assim com os princípios da química verde (ANASTAS; WARNER, 1998).

Fatores e níveis investigados na triagem de P. niruri (½ fatorial com 2 níveis e 5 fatores)


Gráfico da relação entre a região de probabilidades de interferência (%) em função do efeito dos fatores em cada análise

Conclusões

Nas análises por CLAE, utilizando EtOH e H2O, como fase móvel, a porcentagem inicial de EtOH e a temperatura interferiram significativamente na separação dos constituintes químicos presentes na decocção das folhas de P. niruri. Uma vez que as variáveis relevantes foram determinadas, um Planejamento Fatorial Completo poderá ser desenvolvido com o objetivo de estabelecer o melhor método por CLAE para obtenção do perfil cromatográfico das folhas de P. niruri, com menor número de análises do que um desenvolvimento tradicional realizado pela maioria dos analistas (SNYDER; KIRKLAND; GGLAJCH, 1997).

Agradecimentos

FAPESP, CNPq, Prope-UNESP e ao Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes da FC-UNESP.

Referências

ALBRECHT, Ingrid. Identificação de metabólitos secundários em estrato aquoso de Phyllanthus niruri L. com ação no processo de formação de cristais de oxalato de cálcio. 2014. 148 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2014.

ANASTAS, P. T.; WARNER, J. C. Green Chemistry: Theory and Practice. New York: Oxford University Press, 1998. 135 p.

COLOMBO, R. et al. Validated HPLC method for the standardization of Phyllanthus niruri (herb and commercial extracts) using corilagin as a phytochemical marker. Biomed. Chromatogr., v. 23, n. 6, p.573-580, 2009.

FUNARI, C. S.; CARNEIRO, R. L.; ANDRADE, A. M.; CAVALHEIRO, A. J.; HILDER, E. F. Green chromatographic fingerprinting: An environmentally friendly approach for the development of separation methods for fingerprinting complex matrices. Journal of Separation Science, v. 37, p. 37-44, 2014.

SPRENGER, R. F. Caracterização de quatro espécies de quebra-pedra utilizando cromatografia liquida de alta eficiência hifenada a espectrometria de massa em múltiplos estágios. 2011. 139 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Química, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2011.

SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. Practical HPLC method development. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, 1997. 765 p.