ISBN 978-85-85905-19-4
Área
Química Inorgânica
Autores
Fernades de Lima, F. (ICET/UFAM) ; Barreto de Oliveira, C. (ICET/UFAM) ; Gomes Carvalho, K.H. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS (UEA)) ; Gonçalves Brasil Junior, A. (ICET/UFAM)
Resumo
Com o avanço da nanotecnologia, diversos métodos de diagnóstico estão sendo desenvolvidos com objetivo de identificar doenças e contaminantes com agilidade e eficácia. Dentro desse contexto os pontos quânticos apresentam um alto potencial em aplicação em ensaios bioanalíticos.Pontos quânticos (PQs) são nanopartículas inorgânicas fluorescentes obtidas de materiais semicondutores com tamanho médio variando entre 1–10nm. A utilização do PQs possibilitou o desenvolvimento de novos métodos de detecção, no qual vem despertando a anos o interesse de diversos grupos de pesquisa devido suas propriedades e variadas aplicações, tais como, alto rendimento quântico, alta fotoestabilidade, acoplamento com biomoléculas (Bioconjugação), e aplicação como sondas fluorescentes para imunoensaios.
Palavras chaves
Pontos quânticos ; CdTe/MSA; Bioconjugação
Introdução
Pontos quânticos (PQs) são partículas inorgânicas fluorescentes obtidas de materiais semicondutores com tamanho variando entre 1–10nm. Devido suas dimensões reduzidas, esses materiais apresentam estados eletrônicos em regime de confinamento quântico, os quais permitem propriedades ópticas exclusiva. A alteração das dimensões dos PQs de mesma composição química permite que os sistemas nanoestruturados emitam fluorescência em diferentes comprimentos de onda do espectro eletromagnético visível (FRASCO, 2010; PETRYAYEVA, 2013). As pesquisas relacionadas à obtenção de PQs de semicondutores têm como principais objetivos a simplificação dos procedimentos experimentais e obtenção de PQs biocompatíveis. Gaponik et al., foram os primeiros a desenvolver a síntese de pontos quânticos de CdTe estabilizados com alquil-tióis em meio aquoso, configurando como uma alternativa frente as rotas tradicionais em meio orgânico (GAPONIK, 2002). Os compostos orgânicos tiolados, em especial o ácido mercaptosuccínico (MSA) é amplamente empregado na obteção de PQs em meio aquoso com a função de ligante superficial. Os ligantes superficiais possibilitam a bioconjugação do nanomaterial inorgânico à diversas biomoléculas, por meio de reações de acoplamento (covalentes). PQs de CdTe/MSA podem ser bioconjugados a proteínas empregando agentes de acoplamento da classe das carbodiimidas. O acoplamento de PQs a proteínas tem possibilitado aplicações em ensaios diagnósticos, detecção de contaminantes em alimentos, dentre outros bioensaios (SAPSFORD, 2011; PETRYAYEVA, 2013). Dentro desse contexto, o objetivo deste trabalho foi obter bioconjugados de PQs de CdTe/MSA com proteína albumina sérica bovina (BSA) para o emprego em análise de fluorescência em microplaca.
Material e métodos
5.1 Obtenção de CdTe estabilizado com ácido mercaptosuccínico (MSA) Na etapa de obtenção dos PQs de CdTe adicionou-se em um balão 1x10-4 mol de Te°, 400 μL de NaOH 1 mol.L-1 e 3,8x10-3 mol do NaBH4, sob temperatura de 70°C. Após a redução do Te° adicionou-se a solução de íons Te2- em outro balão contendo 6x10-4 mol de MSA e 2x10-4 mol de Cd2+ do reagente Cd(ClO4)2.6H2O, com pH=10,5. O sistema foi submetido à agitação e aquecimento de 90°C por 8h. Depois de resfriar, armazenou-se os PQs em refrigerador. 5.2 Bioconjugação dos PQs de CdTe/MSA com proteína BSA. Os PQs de CdTe foram previamente submetidos a ultrafiltração. Retirou-se uma alíquota de 4 mL de CdTe/MSA e ajustou-se o pH para 5,5. Adicionaram-se os agentes de acoplamento EDC e Sulfo-NHS. Após a ativação dos PQs ajustou-se o pH para 7,2 com PBS 1X. Em seguida, adicionou-se os PQs ativados (1920μL) 80μL de BSA (albumina bovina- 2mg/mL). Deixou-se reagir os PQs de CdTe/MSA com a BSA overnight em refrigerador (2–8°C), para posterior utilização no ensaio de detecção em microplaca. 5.3 Caracterização óptica dos PQs e os bioconjugados obtidos. Os bioconjugados e os PQs de CdTe/MSA obtidos foram submetidos a caracterização óptica (UV/VIS e emissão) 5.4 Confirmação da etapa de bioconjugação por análise de fluorescência em microplaca. A Microplaca negra de poliestireno foi sensibilizada com 150 μL por poço em quintuplicata. Sendo as amostras: CdTe/MSA-BSA, CdTe/MSA não conjugado (controle), solução de BSA (controle). Seguida de incubação overnight em refrigerador. Efetuaram-se 3 lavagens com 150 μL de PBS 1X por poço, e realizaram-se as leituras dos poços contendo as amostras e poços vazios (ruído do equipamento) em leitora de microplacas com filtro de excitação de λ= 365nm e filtro de emissão de λ= 605nm.
Resultado e discussão
Os PQs de CdTe/MSA foram obtidos sob atmosfera não oxidativa. A ausência de
oxigênio é um fator importante para a completa m redução do telúrio e
manutenção dos íons Te2-(PETRAGNANI, 2010; GAPONIK, 2002). O protocolo de
obtenção dos PQs de CdTe/MSA baseou-se em metodologias desenvolvidas e
descritas por (Gaponik ,2002 ; Carvalho, 2014 e Brasil Júnior, 2014). No
final do processo de obtenção, os PQs de CdTe/MSA apresentaram alta
fluorescência, estabilidade e ausência de processos oxidativos. Os espectros
de absorção apresentaram alargamentos nas bandas de absorção, com máximos de
absorção na região entre 530-550nm, característico do material obtido. A
emissão dos PQs foi observada na faixa de ʎ=598nm, estando esse valor na
região do laranja no espectro eletromagnético visível. Através desse
resultado podemos inferir que os PQs obtidos apresentaram uma quantidade
aceitável de defeitos superficiais e boa fluorescência. Os PQs de CdTe/MSA
foram covalentemente ligados a proteína BSA, através dos agentes de
acoplamento EDC e Sulfo-NHS. Esses reagentes promovem a formação de ligações
entre os grupamentos (-NH2) da proteína e os grupamentos (-COOH) da
superfície dos PQs. Os bioconjugados obtidos permaneceram com fluorescência
intensa, sendo ideais para a análise em microplaca. Na caracterização
óptica, os bioconjugados apresentaram um deslocamento na faixa de emissão
para a região do vermelho do espectro eletromagnético visível, indicando o
acoplamento dos PQs a proteína BSA. A confirmação da bioconjugação foi
realizada por análise de fluorescência em microplaca, onde os PQs não
conjugados são retirados na etapa de lavagem, enquanto que os PQs conjugados
a BSA permanecem ancorados a microplaca após a lavagem, devido a interação
da BSA com a superfície dos poços da microplaca.
Nas imagens (A) Exibe os PQs de CdTe/MSA e (B) os bioconjugados (CdTe/MSA-BSA) obtidos sob UV (λ=365nm)
Conclusões
O processo de obtenção dos PQs de CdTe empregando o MSA como agente estabilizante apresentou boa fluorescência, estabilidade satisfatória e ausência de processos oxidativos no sistema. Com isso, os PQs de CdTe/MSA apresentaram emissão em diferentes comprimentos de onda (variando tempo de reação), e boa fluorescência. Os bioconjugados de CdTe continuaram apresentando intensa fluorescência e a metodologia de conjugação não acarreta desnaturação da proteína empregada. Diante do observado, o trabalho desenvolvido apresenta potencial para emprego em bioensaios de detecção por fluorescência.
Agradecimentos
À Fapeam pelo auxílio financeiro Ao ICET/UFAM pelo suporte Ao PPGBIOTEC/UFAM pela utilização da leitora de microplacas Ao Grupo de Pesquisa NANOBIO/UFPE pela caracter
Referências
BRASIL JÚNIOR, Aluizio Gonçalves. Obtenção de bioconjugados anti-NS1 DENV com pontos quânticos fluorescentes como insumos para ensaios diagnósticos da dengue. 2014. 106 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, 2014.
CARVALHO, Kilmara HG et al. Fluorescence Plate Reader for Quantum Dot Protein Bioconjugation Analysis. Journal of nanoscience and nanotechnology, v. 14, n. 5, p. 3320-3327, 2014.
FRASCO, Manuela F.; CHANIOTAKIS, Nikos. Bioconjugated quantum dots as fluorescent probes for bioanalytical applications. Analytical and bioanalytical chemistry, v. 396, n. 1, p. 229-240, 2010.
GAPONIK, N.; Talapin, D.V.; Rogach, A.L.; Hoppe, K.; Shevchenko, H.; Kornowski, A.; Eychmuller, A.; Weller, H. Thiol-Capping of CdTe Nanocrystals: An Alternative to Organometallic Synthetic Routes. J. Physical Chemitry B, 106, 7177-7185 (2002).
PETRAGNANI, Nicola; STEFANI, Hélio A. Tellurium in Organic Synthesis: Second. Academic Press, 2010.
PETRYAYEVA, Eleonora; ALGAR, W. Russ; MEDINTZ, Igor L. Quantum dots in bioanalysis: a review of applications across various platforms for fluorescence spectroscopy and imaging. Applied spectroscopy, v. 67, n. 3, p. 215-252, 2013.
SAPSFORD, Kim E. et al. Analyzing nanomaterial bioconjugates: a review of current and emerging purification and characterization techniques. Analytical chemistry, v. 83, n. 12, p. 4453-4488, 2011.
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