ISBN 978-85-85905-19-4
Área
Iniciação Científica
Autores
dos Santos Dias, A.J. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP) ; Rodrigues Nues, A. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP) ; S. Freitas, R.L. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP) ; F. Batista, E. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP) ; Coutinho dos Santos, D. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP) ; Araujo da Silva, G. (UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ - UEAP)
Resumo
O objetivo do estudo foi avaliar a resposta da Artemia salina (AS) frente a reação de Fenton, usando o método de ensaio que quantifica as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT), propondo assim um método alternativo para avaliação de compostos antioxidantes. A Incubação foi feita de acordo com Persoone et al (1989) e a medição do produto final (SRAT) como descrita por Van Ye et al (1993), com modificações. O resultado médio foi de 2,9798 mmol/mL de SRAT, demonstrando que ocorreu lipoperoxidação dos lipídios. Podemos concluir que o método obteve resultados plausíveis e que, portanto serve de base e como padrão, para experimentos envolvendo a resposta da AS frente a compostos capazes de inibir ou reduzir a peroxidação lipídica nesse organismo, induzida por reação de Fenton.
Palavras chaves
SRAT; Lipoperoxidação; Estresse oxidativo
Introdução
A lipoperoxidação é o processo no qual ocorre a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados, em virtude da ação de radicais livres (HALLIWELL et al, 1986). O fator preocupante dar-se, pois esses ácidos encontram-se presentes também em membranas de células e organelas, resultando em danos a matéria viva. Esses danos podem ser intensificados quando íons de ferro passam a interferir nesse processo gerando outros radicais, altamente reativos. Processos que envolvem o peróxido de hidrogênio (H2O2) com metais de transição como o Fe2+, produzindo um radical HO•, são chamados de reação de Fenton. Embasando-se nas normas éticas internacionais, no qual recomenda-se o uso seguro de animais em pesquisas de laboratório, assim como o desenvolvimento de métodos alternativos, a Artemia salina (Branchipus stagnalis), um microcrustáceo filtrador e bioindicador, foi usado como organismo teste (OT) para elucidar o método. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta biológica da Artemia salina frente a reação de Fenton, usando o método de ensaio que quantifica as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT), propondo assim um método alternativo para avaliação de compostos antioxidantes.
Material e métodos
Após a hidratação de 12 horas, dos ovos de Artemia salina, descartou-se os cistos sobrenadantes e os que afundaram foram lavados em um funil de buchner e em seguida secos com uma bomba a vácuo. A incubação foi feito de acordo com Persoone et al (1989), onde 0,300 g de OT foram adicionados em 400 mL de água salgada artificial, deixando-os por 24h no banho-maria (30±1⁰ C), com iluminação e aeração constante. Preparou-se uma solução de sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) com 0,2780g em 100 mL de água destilada. Para a indução da peroxidação por reação de Fenton, transferiu-se 5 mL da solução de FeSO4 para o balão volumétrico e mais 351,87 µL de H2O2 (10%) aferindo com água salgada até a medida de 100 mL. Após o tempo de incubação transferiu-se o preparo da reação para o Erlenmeyer com OT, deixando-os por mais 24 horas. Para se medir a concentração do produto final (SRAT) foi utilizado a metodologia descrita por VanYe et al (1993) com modificações. Onde ao fim da indução de peroxidação, as Artemias salinas foram filtradas por uma bomba a vácuo. Pesou-se 0,259 g de amostra para o ensaio e homogeneizou-se em um gral de porcelana com 5 mL de solução tampão fosfato (pH 7,2). Centrifugou- se a mistura à 3500 rpm por 5 minutos e ao final foi transferido para triplicatas, 1 mL da amostra e 2 mL de TCA-TBA reagente (15% p/v de ácido tricloroacético, o TCA e 0,375% de ácido tiobarbitúrico, TBA). A mistura foi aquecida por 15 minutos em banho-maria (90-100⁰C) e após o resfriamento, o precipitado foi removido por centrifugação à 5000 rpm por 1 minuto. A absorvância de SRAT no sobrenadante foi registrado a 535 nm, no espectrofotômetro, contra um branco contendo água destilada.
Resultado e discussão
O resultado do estudo foi de 3,1302 mmol/mL, 3,0597 mmol/mL e 2,7495
mmol/mL, obtendo-se um valor médio com 2,9798 mmol/mL de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT), demonstrando que ocorreu
lipoperoxidação dos lipídios, componentes celulares dos organismos teste.
Métodos alternativos ao uso de animal que citem a utilização de Artemia
salina para avaliação e análise da atividade antioxidante de produtos
naturais, ainda não foram reportadas na literatura. A vantagem desse método
frente aos métodos já descritos está evidenciado quanto ao meio biológico de
fácil manipulação e baixo custo econômico. Serão realizados estudos futuros
para avaliação do metabolismo de defesa antioxidante (SOD, GPX, GSH, GSSG e
ORAC) com extratos de plantas fitoterápicas, onde espera-se que esse método
alternativo alcance resultados próximo aos de análises feitas em ratos e que
tenha-se uma relevância igual ou superior aos testes feitos em meio químico
(DPPH, fosfomolibdato, entre outros).
Conclusões
Podemos concluir que o método alternativo obteve resultados plausíveis e que, portanto, serve de base e como padrão, para experimentos envolvendo a resposta da Artemia salina frente a compostos capazes de inibir ou reduzir a peroxidação lipídica nesse organismo vivo, induzida por reação de Fenton.
Agradecimentos
CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico) e UEAP (Universidade do Estado do Amapá).
Referências
HALLIWELL, Barry; GUTTERIDGE, John MC. Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Archives of biochemistry and biophysics, v. 246, n. 2, p. 501-514, 1986.
PERSOONE, G. et al. Predictive value of laboratory tests with aquatic invertebrates: influence of experimental conditions. Aquatic Toxicology, v. 14, n. 2, p. 149-167, 1989.
VAN YE, Todd M. et al. Inhibition of intestinal lipid peroxidation does not minimize morphologic damage. Journal of Surgical Research, v. 55, n. 5, p. 553-558, 1993.
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