ISBN 978-85-85905-19-4
Área
Iniciação Científica
Autores
da Costa Rodrigues, B. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Clodomiro dos Santos Lucena, M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Carolina Rêgo Costa, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Beckman, D. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Teixeira Ferreira, S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Garcia de Mello, F. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Regiana Todeschini, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Augusto de Melo Reis, R. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO) ; Barbosa Dias, W. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO)
Resumo
A via biossintética das hexosaminas possui a glutamina frutose-6-fosfato aminotransferase (GFAT) como enzima limitante, que converte frutose-6- fosfato em glicosamina-6-fosfato; e possui o UDP-GlcNAc como produto final. Este pode ser utilizado como substrato para uma modifiação pós-traducional (O-GlcNAc) resultante da adição covalente de uma N-acetilglicosamina (GlcNAc) à grupamentos hidroxila em resíduos de serinas e/ou treoninas de proteínas. A tirosina hidroxilase (TH) é uma enzima responsável por catalisar a reação de hidroxilação da L-tirosina na posição meta, gerando di-hidroxifenilalanina (L-DOPA). Este trabalho tem como objetivo demonstrar que o O-GlcNAc atua no controle dos níveis de fosforilação na serina 40 da TH, modulando sua atividade e a síntese de dopamina.
Palavras chaves
O-GlcNAc; Dopamina; Tirosina hidroxilase
Introdução
A via biossintética das hexosaminas utiliza cerca de 2% a 5% da glicose que entra nas células, possuindo a glutamina frutose-6-fosfato aminotransferase (GFAT) como enzima limitante, que converte frutose-6-fosfato em glicosamina- 6-fosfato. Esta via terá como produto final o UDP-GlcNAc, que além das glicosilações clássicas, é utilizado como substrato para o O-GlcNAc intracelular; uma modifiação pós-traducional (MPT) resultante da adição covalente de uma N-acetilglicosamina (GlcNAc) à grupamentos hidroxila em resíduos de serinas e/ou treoninas de proteínas, tanto nucleares quanto citoplasmáticas e mitocondriais. Esta reação é catalisada pela O-GlcNAc transferase (OGT), sendo a reação de remoção deste monossacarídeo feita pela O-GlcNAcase (OGA). O balanço da atividade de tais enzimas irá regular os níveis de O-GlcNAc em proteínas, sendo a O-GlcNAcilação, semelhante à fosforilação, altamente induzível, dinâmica e atuante em diversos processos celulares, tais como a progressão do ciclo celular, transcrição, resposta à stress celular, alzhaimer, parkinson, entre outros. A tirosina hidroxilase (TH) é uma enzima responsável por catalisar a etapa limitante na síntese de catecolaminas, hidroxilando a L-tirosina na posição meta para obtenção de di-hidroxifenilalanina (L-DOPA). Existe apenas uma evidência na literatura de que a TH é O-GlcNAcilada, e que a diminuição dos níveis desta modificação pós-traducional estimula a secreção de dopamina em células PC12 (feocromacitoma de rato); porém, o mecanismo de como tal fato ocorre, permanece desconhecido. A partir disto, nosso grupo mostrou que a O- GlcNAcilação atua no controle dos níveis de fosforilação na serina 40 da TH, modulando sua atividade e consequentemente os níveis de dopamina.
Material e métodos
Para analisar a influência que uma MPT exerce sobre a outra, Células PC12 foram tratadas com nerve growth factor (NGF), um indutor de neuritogênese e síntese de dopamina, por 48 horas e 72 horas; e com o inibidor farmacológico da OGA, Thiamet G (TMG) por 4 horas. Em seguida, as células foram lisadas, centrifugadas a 14.000 rpm por 20 minutos 4ºC, e o sobrenadante foi coletado e submetido a dosagem de proteína utilizando o método de Bradford. Para cada amostra, 25 µg de proteína foram usados para SDS-PAGE, tranferidos para membranas de nitrocelulose e marcados com anti-O-GlcNAc, anti-TH, anti- fosfo- TH ser40, anti-GFAT, anti-OGA e anti-GAP43 para análise de seus níveis nas diferentes condições. Anti-actina e anti-tubulina foram utilizados como controle de carregamento. Os níveis de dopamina foram quantificados por HPLC acoplado com detecção eletroquímica, seguindo um protocolo adaptado de Arita e colaboradores. Ácido perclórico foi adicionado com concentração final de 0.1M em células PC12 e sobrenadante em condições não tratadas e tratadas com TMG por 4 horas. Células foram sonicadas (2 pulsos de 5s, 50 Hz) e centrifugadas (1000 x g por 10 minutos), e o sobrenadante foi utilizado para a quantificação. Separação isocrática foi obtida usando coluna de fase reversa LC-18 (4.6x250 nm). Uma reação in vitro envolvendo a TH recombinante, OGT e UDP-GlcNAc foi realizada com o objetivo de visualizar a O-GlcNAcilação da enzima por Western blot, e esta amostra contendo uma alta fração da enzima com a modificação pós-traducional foi levada a análise por espectrometria de massas, com o objetivo de mapeamento de sítios de O-GlcNAcilação.
Resultado e discussão
O tratamento com NGF aumenta os níveis de fosforilação na serina 40 da TH ao
aumentar seu tempo de exposição, enquanto os níveis de O-GlcNAc diminuem na
banda do peso molecular da enzima (60 kDa). Em contra partida, o aumento
dos níveis intracelulares de O-GlcNAc exercido pelo uso do TMG diminui os
níveis de fosforilação na serina 40 da TH; sugerindo uma competição entre o
O-GlcNAc e o fosfato pelo sítio na enzima e; pela fosforilação na serina 40
ser bem estabelecida no aumento da atividade enzimática, os dados indicam
que a regulação por O-GlcNAc também participa na modulação de tal atividade.
Com o intuito de investigar as implicações de tal modulação na via de
biossíntese de catecolaminas, foi realizada a dosagem de dopamina por HPLC
nas condições não tratada e tratada com TMG por 4 horas e, como resultado,
os níveis de dopamina total diminuem significativamente com o tratamento com
TMG; corroborando com o fato de o aumento nos níveis de O-GlcNAc diminuir os
níveis de fosforilação na serina 40, e consequentemente diminuir a atividade
enzimática da enzima limitante desta via.
Por fim, a análise dos níveis de O-GlcNAc na reação in vitro por western
blot mostra que o sistema que continha UDP-GlcNAc apresenta níveis de O-
GlcNAcilação maiores do que o sistema de controle negativo; dando mais um
indício de que a enzima possui sítio para esta modificação pós-traducional.
Análises por espectrometria de massas estão sendo realizadas para
confirmação de tal(is) sítio(s) de O-GlcNAc na enzima.
Tais resultados sugerem um mecanismo que integra o metabolismo de glicídeos
(pela HBP), com a via de biossíntese de catecolaminas; em que a competição
de O-GlcNAc e fosfato pelo sítio de serina 40 da TH regula sua atividade, e
consequentemente a síntese de catecolaminas.
Conclusões
As análises dos resultados sugerem que, de fato, existe uma correlação entre os níveis de O-GlcNAc e fosforilação da serina 40 na tirosina hidroxilase em células PC12; e que o balanço dessas modificações pós-traducionais regula a atividade da enzima, consequentemente controlando os níveis totais de síntese de dopamina.
Agradecimentos
CNPq, CAPES, FAPERJ
Referências
Bobrovskaya L, Gilligan C, Bolster EK, Flaherty JJ, Dickson PW, Dunkley PR. Sustained phosphorylation of tyrosine hydroxylase at serine 40: a novel mechanism for maintenance of catecholamine synthesis. J Neurochem. 2007;100: 479-89.
Bork K, Kannicht C, Nöhring S, et al. N-propanoylmannosamine interferes with O-GlcNAc modification of the tyrosine 3-monooxygenase and stimulates dopamine secretion. J Neurosci Res. 2008;86: 647-52.
Dunkley PR, Bobrovskaya L, Graham ME, Von nagy-felsobuki EI, Dickson PW. Tyrosine hydroxylase phosphorylation: regulation and consequences. J Neurochem. 2004;91: 1025-43.
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