Perfil químico e atividades leishmanicida dos extratos de fungos endofíticos de Aspidosperma excelsum.

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Iniciação Científica

Autores

Luz, L.A.S. (UFPA) ; Carvalho, J.M. (UFPA) ; Feitosa, A.O. (UFPA) ; Dolabela, M.F. (UFPA) ; Marinho, A.M.R. (UFPA)

Resumo

Visando contribuir para o estudo químico de fungos endofíticos, coletou-se a planta Aspidosperma excelsum. Espécies do gênero aspidosperma apresentam uma importante característica que é a presença de alcaloides indólicos, em sua maioria monoterpênicos, os quais possuem uma variedade de atividades biológicas. Após a assepsia do material vegetal, pequenos fragmentos da planta foram inoculados em placa de Petri contendo meio BDA (batata, destroxe, ágar) e incubados em estufa BOD para crescimento das colônias, os fungos obtidos foram purificados e isolados através de repiques sucessivos somando um total de 26 fungos, dos quais realizou-se o perfil químico por HPLC e posteriormente testou-se o potenciais leishmanicidas frente às formas promastigotas de Leishmania amazonenses.

Palavras chaves

Fungos endofíticos; atividade leishmanicida; perfil químico

Introdução

Leishmanioses são doenças tropicais causadas por protozoários do gênero Leishmania. Estas infectam em torno de 12 milhões de pessoas em 80 países do mundo e é estimado que existam 3 milhões de novos casos por ano (CARVALHO, 2014). As várias formas de manifestação da doença têm sido usadas pela Organização Mundial de Saúde como base para classificar as leishmanioses em quatro formas: a) visceral, b) cutânea- mucosa, c) cutânea difusa ou disseminada e d) cutânea. No Brasil as leishmanioses são um sério problema de saúde publica, tendo crescido consideravelmente com o passar dos anos. Os parasitas que mais ocorrem no país são L. (Leishmania) chagassi causador da leishmaniose visceral e L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis causadores da leishmaniose cutânea (RABELLO et al., 2010). Os tratamentos medicamentosos disponíveis para as leishmanioses são à base de remédios antimoniais pentavalentes, como o Pentostan® e Glucantime®, que são tóxicos e nem sempre efetivos. Por isso, se faz necessária buscar novas fontes de medicamentos que sejam eficazes no tratamento desta doença (CARVALHO, 2014). Espécies do gênero Aspidosperma, da família Apocynaceae, são ricas em alcaloides indólicos que apresentam um amplo espectro de atividades biológicas e apresentam amplas propriedades medicinais. Poucos metabólitos secundários com atividades antileishmania proveniente de fungos endofiticos são reportados na literatura, destacando-se os metabolitos citreoroseina e janthinona que apresentaram alta atividade leshmancida. Tais metabolitos foram obtidos do fungo Penicillium janthinellum isolado como endofitico Melia azedarach (MARINHO, 2005). Assim, o presente trabalho tem por objetivo a obtenção de extratos da biomassa de fungos endofíticos de Aspidosperma excelsum.

Material e métodos

Neste trabalho foram isolados os fungos endofíticos da planta hospedeira Aspidosperma excelsum. Após ser realizada a assepsia do material vegetal pequenos fragmentos foram inoculados em placa de Petri contendo meio BDA (batata, destroxe, ágar) e incubados em estufa BOD para crescimento das colônias, os fungos obtidos foram purificados através de repiques sucessivos. Após isolados e purificados, foram cultivados em placa de Petri contendo meio BDA por 20 dias, em seguida foram retirados pequenos fragmentos do micélio e transferiu-os para frascos de 10 mL e adicionou-se uma mistura de solventes acetato de etila/ diclorometano/ metanol 3:2:1 e levou-se ao banho ultrassônico por 30 min para extração, por fim, filtrou-se o material e o filtrado foi seco para obtenção do micro-estrato. Os extratos brutos obtidos foram submetidos à analise do perfil cromatorgrafico por HPLC/PDA em gradiente exploratório. O sistema utilizado para a analise em HPLC foi coluna analítica Sunfire tipo octadecil silano (C-18) 5µ e eluição em gradiente H2O/MeOH (90:10 → 0:100) por 50 min., retomando a condição inicial após 10 min., com fluxo de 0,5 mL/min e λ variando de 210 à 600 nm e a temperatura da coluna foi mantida à 40 ºC. O ensaio leishmanicida foi realizado in vitro com as formas promastigotas do parasita. Os extratos foram adicionados a cultura de promastigotas com 4x106 cel/mL nas concentrações de 320 a 0,125µg/mL solubilizados em DMSO e incubados, a 25ºC, por 24h. Após esse período os parasitas sobreviventes foram contados em câmara de Neubauer e comparados com controles, os quais continham somente DMSO. Anfotericina B (Eurofarma®) foi usado como fármaco de controle. O valor de DL50/24 foi determinado pela analise de regressão linear do percentual de inibição com erro estatístico de 10%.

Resultado e discussão

A espécie vegetal Aspidosperma excelsum pertence à família Apocynaceae. Espécies do gênero Aspidosperma apresentam uma importante característica que é a presença de alcalóides indólicos, em sua maioria monoterpênicos, os quais possuem uma variedade de atividades biológicas, dentre elas a atividade leishmanicida. Os alcalóides indólicos são caracterizados pela presença do grupo indol, sendo que este grupo pode ser observado pelo seu espectro de UV que apresenta as bandas de absorção próximas a 218, 256 e 292 nm (PERREIRA, et al 2007). Com base nisso resolveu-se fazer o perfil químico em HPLC/DAD, por ser um método mais rápido e confiável de detecção, na busca de substancias produzida pelos fungos isolados da planta A.excelsum e que possuam o grupo indol. No presente trabalho, foram isolados da planta A. excelsum 26 fungos, os quais ainda estão em fase de identificação. Após a analise do perfil químico destes fungos, foram selecionados os fungos AEC 02, AEC 08, AEC 09, AEC 11, AEC 12 e AEC 14, pois apresentaram em seus cromatogramas, inúmeras bandas de media e alta intensidade com variados tempos de retenção e com absorções no espectro de UV (Figura 1) similar ao padrão espectral apresentado por alcalóides indólicos, o que sugere que estes extratos fúngicos possuem uma variedade de compostos que apresentam grupos indóis em sua estrutura. Devido a estes resultados, os extratos desses fungos foram submetidos ao ensaio leishmanicida, sendo o extrato AEC 11 foi o que apresentou melhor resultado com CI50 de 6.539 µg/mL (Figura 2).

Conclusões

Foram isolados 26 endófitos de A. excelsum, dos quais seis mostraram-se promissores após a analise do perfil químico em HPLC/DAD, devido às bandas apresentadas em seus cromatogramas que sugerem a presença de substâncias que possuem o grupo indol em sua estrutura, grupo conhecido por apresentar atividade leishmanicida. Dos extratos fúngicos testados frente às formas promastigotas de Leishmania amazonensis, o extrato do fungo AEC 11 apresentou ótimo resultado com CI50 de 6.539 µg/mL, o que corrobora com o objetivo deste trabalho.

Agradecimentos

CNPq, CAPES, FAPESPA, VALE, UFPA.

Referências

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