Novos policetídeos com atividade antibacteriana isolados do fungo Exserohilum rostratum endófito de Bauhinia guianensis.

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Iniciação Científica

Autores

Pina, J.R.S. (UFPA) ; Pinheiro, E.A.A. (UFPA) ; Leite, E.A. (UFPA) ; Marinho, A.M.R. (UFPA)

Resumo

Circunscrito ao estudo da química de microrganismos, encontra-se este estudo, que a partir de uma matriz vegetal (Bauhinia guianensis) isolou-se a espécie fúngica Exserohilum rostratum 1.11 Er, ao qual foi obtida a biomassa e assim foram isolados, os esteroides ergosterol (1) e peróxido de ergosterol (2); a isocumarina, monocerina (3) e os policetídeos de ocorrência inédita na literatura, denominados de annularina I (4) e annularina J (5). Concomitante foram realizados ensaios antimicrobianos. As annularinas I (4) e J (5) apresentaram boas atividades bacteriostática, frente à B. subtilis e E. coli, destacando-se 4 que apresentou atividade bacteriostática na mesma concentração do antibiótico de referência. Quanto ao ensaio de citotoxidade as substâncias mostraram-se inativas.

Palavras chaves

Exserohilum rostratum; Annularina I; Annularina J

Introdução

O advento da penicilina descoberta por Alexander Fleming (1928) reestruturou a busca por compostos com atividades farmacológicas, sendo então utilizada como alicerce a prospecção química em cultura microbiana; revolucionado a terapêutica no controle de doenças infecciosas podendo estas serem controladas e debeladas. As novas fontes de pesquisas tem como base o isolamento de microrganismos de diversos ambientes, a fim de se obter as mais variadas classes de metabólitos secundários. Circunscritos neste contexto, os fungos endofíticos habitam tecidos vegetais sem lhe causar danos aparentes (STADLER; SCHULZ, 2009), além disso, estes são importantes fontes de obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica, sendo muita destas de ocorrência inédita o que justifica ainda mais estudar a ocorrência de metabólitos bioativos provenientes desta relação visando sua aplicabilidade na indústria farmacêutica, agricultura, dentre outras. Assim, os fungos endofíticos podem ser uma fonte útil, versátil e renovável de muitas substâncias potencialmente úteis à humanidade (MARINHO; RODRIGUES-FILHO, 2011) e uma importante fonte estratégica no combate a infecções emergentes, ao qual, segundo Lima (2013) a ocorrência de óbitos ocasionados por doenças infeciosas correspondeu a 25% de todas as mortes em 2013. Tendo em vista a exímia produção de moléculas bioativas e na interação planta- hospedeiro, este trabalho pretendeu investigar o potencial químico de Exserohilum rostratum 1.11 Er isolado como endofítico de Bauhinia guianenses, uma matriz vegetal da região amazônica. Com isso, este estudo entra consonância na prospecção de moléculas com atividade antimicrobiana visando contribuir ao arsenal da química de microrganismos.

Material e métodos

A cepa do fungo Exserohilum rostratum 1.11 Er encontrava-se preservada no Laboratório de Bioensaios e Química de Microrganismos (LaBQuiM/UFPA). O fungo E. rostratum 1.11 Er foi reativado em placa de Petri contendo o meio B.D.A. Ao oitavo dia de incubação foi realizado o cultivo do fungo em meio sólido (arroz Tio João®). Foram utilizados 90 g do cereal, que foram distribuídos uniformemente em 25 frascos de Erlenmayer de 1.000 mL com a adição de 75 mL de água destilada em cada frasco, os frascos foram autoclavados durante 45 minutos a 121 ºC. Em 22 frascos foram adicionados pellets contendo o micélio do fungo, restando 3 frascos para o controle. Decorrido 25 dias de crescimento em modo estático e ausente de luz, a biomassa do fungo foi macerada com hexano, acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH). As soluções obtidas foram concentradas em evaporador rotativo. A fase AcOEt do extrato metanólico (FAEM) foi submetida a sucessivos fracionamentos por cromatografia em coluna de sílica gel tendo como eluente hexano, AcOEt e MeOH em ordem crescente de polaridade. Os extratos e as substâncias tiveram suas atividades antimicrobianas avaliadas pelo método de diluição sucessiva em microcaldo recomendado pela Subcomissão de Teste à Subsceptibilidade Antifúngica do Comitê Nacional dos EUA para Padrão Clínico Laboratorial (CLSI, 2003), e comparadas com o antibiótico de uso clínico, terramicina. As cepas das bactérias foram cedidas pelo Instituto Evandro Chagas. O ensaio de citotoxidade preliminar frente a Artemia salina seguiu-se baseado na metodologia de Fontenele e colaboradores (1988) e o EPA Probit Analysis Program foi utilizado para estimativa acerca da DL50% do Método de Análise de Probitos.

Resultado e discussão

O composto ergosterol (1), peróxido de ergosterol (2) e monocerina (3) tiveram suas estruturas elucidadas através de RMN 1H e 13C e os dados confrontados com os da literatura mostrando-se tratar de dois esteroides 1 e 2, e de uma isocumarina 3. (Figura 01) A fórmula molecular do composto 4 foi determinada como sendo C11H14O3 (ESI (+), m/z 197), na análise do espectro de RMN 1H de 4 observa-se sinais da cadeia lateral de hidrocarboneto, um grupo metoxila e o sinal de hidrogênio olefínico. Além de um singleto δH 2,19 atribuída a metila ligada ao carbono sp2. No espectro de RMN 13C são observados sinais referentes a 11 átomos de carbono, sendo o sinal de carbono em δc 164,8 característico de carbonila de grupo lactônico (LI et al., 2003). Apresentando semelhanças espectrais, o composto 5 tem a fórmula molecular proposta de C11H16O4 (ESI (+), m/z 213). No espectro de RMN 1H e 13C DE 5 a substituição do sinal da metila Me-11 em δH 2,19 e δC 17,1 por δH 4,44 e em δC 58,8 que pelo DEPT trata-se de um grupo CH2. Com bases nos dados obtidos e os da literatura, 4 e 5 são policetídeos inéditos, pertencentes a classe das annularinas e têm sido chamados annularina I (4) e annularina J (5). Dados de RMN 1H e 13C para 4 e 5 estão apresentados na Tabela 01. Os compostos 4 e 5 mostraram uma boa atividade antimicrobiana, segundo Holetz e colaboradores (2002), a annularina I (4) e annularina J (5) tiveram efeito bacteriostático frente a E. coli até a concentração de 15,62 μg mL-1 e frente a B. subtilis apresentaram atividade bacteriostática, sendo que a annularina I (4) na mesma concentração do antibiótico usado (7,81 μg mL-1) e annularina J (5) na concentração de 15,62 μg mL-1. Quanto ao ensaio de citotoxicidade as annularinas I e J mostraram-se inativas.

Substâncias isoladas de Exserohilum rostratum 1.11 Er, endófito de Bauhinia guianenses.


Atribuição dos dados de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) e RMN 13C (75 MHz, CDCl3) de 4 e 5.

Conclusões

A investigação química de E. rostratum Er 1.11 resultou no isolamento de dois novos compostos, annularina I e J. Os compostos isolados tiveram seu potencial antimicrobiano avaliado, e mostraram uma boa atividade bacteriostática frente Escherichia coli e Bacillus subtilis, além de serem inativa frente à Artemia salina no ensaio de citotoxicidade preliminar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a FAPESPA e a VALE pelo suporte financeiro, e ao CNPq pela bolsa de estudo concedida (J.R.S.P).

Referências

CLSI - Clinical and Laboratory Standars Institute. Methods for Dilution and Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, v.23, n.02, CLSI Approved Standard M7-A4: Wayne-PA, 2003.
FONTENELE, A.J.; CARVALHO, U.; MELO, V.M.M.; BRAGA, L.M.; AGUIAR, A.; MATOS, F.J.A. A avaliação da toxicidade de extratos de plantas medicinais através de bioensaio com Artemia salina Leach. Ciência e Cultura, v. 40, n. 11, p. 11091111, 1988.
HOLETZ, F.B.; PESSINI, G.L.; SANCHES, N.R.; CORTEZ, D.A.G.; NAKAMURA, C.V.; FILHO, B.P.D. Screening of some plants used in the Brazilian Folk Medicine for the Treatment of Infectious Diseases. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, n. 07, p. 1027-1031, 2002.
LI, C.; NITKA, M.V.; GLOER, J.B.; CAMPBELL, J.; SHEARER, C.A. Annularins A-H: new polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Annulatascus triseptatus. Journal of Natural Products, v.66, n.10, p.1302-1306, 2003.

LIMA, S.M.A. Avaliação das atividades antimicrobiana e citotóxica de metabólitos secundários produzidos pela actinobactéria ACTMS-9H isolada da rizosfera de Paullinia cupana Kunth. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. Recife, 2013.
MARINHO, A. M. R.; RODRIGUES-FILHO, E. Dicitrinol, a citrinin dimer, produced by Penicillium janthinellum. Helvetica Chimica Acta, v.94, n.5, p.835-841, 2011.
STADLER, M.; SCHULZ, B. High energy biofuel from endophytic fungi? Trends Plant Science, v.14, n.7, p.353–355, 2009.