ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FLORES E FRUTOS COLETADOS NO CAMPUS RECIFE DA UFPE E AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE AMILASE DOS ISOLADOS

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

da Silva Neto, L.J. (UFPE) ; de Albuquerque, S.S.M.C. (UFPE)

Resumo

O objetivo do trabalho foi isolar leveduras de flores e de alguns frutos, encontrados no campus Recife da Universidade Federal de Pernambuco, assim como o estudo da atividade amilolítica das mesmas. Para isolamento das leveduras, utilizou-se o meio de cultura caldo glicosado com pH ácido e o meio glicose ágar para obtenção das culturas em meio sólido. A avaliação da atividade enzimática foi realizada em placas de Petri contendo o meio de cultura com 0,2% de amido solúvel. As leveduras foram identificadas através das características macroscópicas das colônias, observações “in vivo” e coloração simples. Dentre os isolados, observou-se que aproximadamente 55 % das espécies de leveduras apresentou produção de amilase quando cultivadas em meio contendo amido.

Palavras chaves

leveduras; flores; amilase

Introdução

Estimativas apontam que somente 5 % dos fungos receberam classificação formal. Além disso, o fato da biodiversidade do Brasil ser grande indica que a probabilidade de descoberta de novas espécies é alta (MAUTONE, 2008). As leveduras têm utilidade biotecnológica para os seres humanos desde antes do ano 6.000 a.C. na produção de alimentos. Sabe-se há, aproximadamente, um século, que as leveduras se desenvolvem em flores. Porém, poucas pesquisas foram feitas a fim de se identificar os micro-organismos presentes em tais habitat (GAVIRIA; OSORIO, 2012). Na cidade do Recife, a média de temperatura é de 25 °C com variações que, normalmente, não excedem os 5 °C. A umidade atmosférica média é de 84 %. Tais condições são propícias ao desenvolvimento de um considerável número de espécies. As leveduras encontram diversas aplicações na indústria, como na fabricação de emulsificantes, bebidas alcoólicas, pães, molho shoyu, vitaminas (MONTEIRO et al., 2010), síntese de enzimas e podem, também, ser usadas como fonte direta de alimento. A amilase é uma das enzimas mais importantes biotecnologicamente por corresponder a uma porcentagem da demanda mundial entre dez e quinze por cento, sendo o segundo tipo de enzima mais produzido. As enzimas amilolíticas têm amplo uso na indústria de panificação, na produção de ração animal, xaropes de glicose, adoçantes, bebidas fermentadas, etanol, nas industrias de papel e têxteis. Na indústria de alimentos, o amido é empregado como espessante, aglutinante, estabilizante, emulsificante, geleificante, como agente de liga, entre outros. O objetivo do trabalho foi realizar o isolamento de leveduras a partir de flores e alguns frutos do campus Recife da UFPE e estudar a atividade amilolítica dos isolados.

Material e métodos

As flores foram coletadas no período da manhã com o auxílio de materiais desinfectados, sendo transportadas de imediato para o laboratório onde foram cortadas e introduzidas em Erlenmeyers contendo Caldo Glicosado acidificado com ácido lático até pH 4,0. Realizou-se a incubação em estufas a temperatura ambiente por 48 horas. Para o isolamento em meio sólido, utilizou-se o meio Glicose Ágar, que foi fundido e resfriado a 45 °C e adicionado às placas de Petri. Após solidificação do meio, foram feitas inoculações em sua superfície realizando-se o esgotamento do líquido coletado da amostra com o auxílio de uma alça em “o”. Com o intuito de identificar o melhor método de obtenção de colônias isoladas, também foi realizada a técnica de semeadura por espalhamento, onde 0,1 ml do inóculo foi transferido com o auxílio de uma pipeta estéril, após o período de incubação, para o centro de uma placa de Petri contendo o meio de Glicose ágar solidificado. Em seguida utilizou-se uma alça de Drigalski estéril e espalhou-se o volume depositado pela superfície do meio. As colônias de leveduras foram repicadas para tubos contendo meio de Glicose ágar inclinado e incubadas a temperatura ambiente durante 48 horas. As leveduras foram identificadas pelas características morfológicas e microscópicas. Após a incubação, foram selecionadas colônias típicas de leveduras. Foram realizadas observações in vivo utilizando-se microscópio óptico, para confirmar a presença da levedura. As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo o meio de Agar Nutritivo (AN) com 0,2% de amido solúvel. Após incubação de 48 horas, adicionou-se uma solução de iodo (lugol) capaz de corar o amido de azul. Pela ausência de coloração na região hidrolisada, evidenciou-se a produção de amilase.

Resultado e discussão

Os vegetais estudados foramMussaenda alicia, Duranta repens, Lagerstroemia speciosa, um vegetal de flores vermelhas não identificado, Eugenia uniflora, Ixora coccínea, Plumeria pudica,Alpinia purpurata, Rhododendron spp, Bougainvillea glabra, um vegetal de flores amarelas não identificado, Delonix regia e Lilium sp. Em todas as espécies, foram encontradas leveduras. As colônias selecionadas no meio de glicose ágar foram analisadas de acordo com as suas características macroscópicas e microscópicas. Foram estudadas vinte e uma colônias, de tamanhos variados, tonalidades bege, rosa e laranja, com formatos tanto circular como irregular. As culturas isoladas de leveduras foram observadas com o auxílio de microscópio óptico (Figura 1). O formato das células variava entre ovaladas, elípticas e circulares, sendo que algumas espécies apresentavam pseudomicélios. Notou-se a predominância de reprodução por brotamento. Para verificar se houve ou não a produção de amilase, as placas foram observadas e analisadas através da produção de halos amilolíticos. Foram isoladas onze leveduras positivas e dez negativas para a prova da amilase. Santos (2012) obteve doze isolados de leveduras de flores bromélia de afloramento rochoso no morro da Pioneira-Bahia, dos quais 58% produziam amilase. Peixoto (2006) analisou a produção de enzimas amilolíticas a partir de amostras coletadas do solo, pólen e frutos de diversas regiões do país como: Cerrado, Floresta Amazônica e Mata Atlântica. Dentre as cepas testadas para atividade amilolítica em meio sólido, aquelas coletadas na região da Floresta Amazônica apresentaram maiores atividades em relação às cepas coletadas no Cerrado e na Mata Atlântica.

Na figura, vê-se uma amostra de células de levedura coradas com azul de metileno, observadas com o auxílio de microscópio óptico.

Conclusões

Nas doze amostras de flores investigadas, foram encontradas espécies de leveduras. Apesar das flores terem sido de espécies diferentes e coletadas, também, em ambientes diferentes, podemos concluir que algumas flores continham as mesmas espécies de leveduras, baseando-se nas características macroscópicas e microscópicas. Das 21 leveduras isoladas, 11 foram positivas para amilase. É possível que, utilizando meios especiais e metodologias mais elaboradas, sejam detectadas outras espécies.

Agradecimentos

Referências

GAVIRIA, J. V.; OSORIO, E. C. Diversidad de Levaduras Asociadas a Inflorescencias de Mango y Flores de "Lulo Arboreo". Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. v. 10, n. 2, pp. 160-169. Popayán, Cauca, Colômbia, 2012.

MAUTONE, J. N. Diversidade e Potencial Biotecnológico de Leveduras e Fungos Semelhantes a Leveduras Isoladas de Folhas de Figueiras do Parque do Itapuã. 2008. 113 f. Dissertação de mestrado. Instituto de Ciências Básicas da Saúde, UFRS, Porto Alegre, 2008.

MONTEIRO, A. S.; BONFIM, M. R. Q.; DOMINGUES, A. C.; SIQUEIRA, E. P.; ZANI, C. L.; SANTOS, V. L. Identification and Characterization of Bioemulsifier-Producing Yeasts Isolated from Effluents of a Dairy Industry. Bioresource Technology. v. 101, n. 14. pp. 5186-5193. Belo-Horizonte, MG, 2010.

PEIXOTO, A. B. Estudo da Produção de Enzimas e Gomas de Leveduras Selvagens Coletadas em Diversas Regiões do Brasil. 84f Dissertação de mestrado. Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2006. Disponível em: http://goo.gl/EhZ0Pq. Acesso em: 04/12/2015.

SANTOS, T. T. Identificação e Análise do Potencial Enzimático de Leveduras Isoladas do Afloramento Rochoso do Morro do Pioneira – Bahia. Trabalho de Conclusão de Curso. Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Cruz das Almas, BA, 2012. Disponível em: http://goo.gl/AmMBoC. Acesso em: 04/12/2015.