POTENCIAL AMILOLÍTICO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS DA FERMENTAÇÃO NATURAL DE CACAU EM TUCUMÃ, PARÁ

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Araújo, J.A. (UFPA) ; Ferreira, A.S.C. (UFPA) ; Silva, C.L. (UFPA) ; Alves, Y.F.M. (UFPA) ; Ferreira, N.R. (UFPA) ; Lopes, A.S. (UFPA)

Resumo

Objetivou-se isolar os fungos filamentosos presentes na fermentação natural do cacau realizada no Município de Tucumã, PA e avaliar o potencial enzimático na atividade amilololítica. As sementes de cacau foram coletadas nos tempos 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de fermentação. O isolamento foi realizado conforme a metodologia descrita pelo of Methods for the Microbiological Examination of Foods. O Índice Enzimático - IE foi obtido mediante a relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio do micélio do fungo. Apenas dois isolados apresentam atividade extracelular satisfatória na produção de amilase. Com isso, é importante que futuramente sejam identificados esses fungos filamentosos, uma vez essa enzima possui ampla aplicação industrial.

Palavras chaves

Amilase; Indústria; Micro-organismo

Introdução

Os fungos filamentosos são encontrados durante todo o processamento primário das sementes de cacau (fermentação, secagem e armazenamento) (MOUNJOUENPOU et al., 2008). Possuem a habilidade de se desenvolverem em diversos materiais de origem vegetal e exercem na natureza a função de hidrolisar compostos orgânicos (MAHESHWARI et al., 2000). Fungos filamentosos são potenciais produtores de enzimas extracelulares, esses representam a mais ampla classe de enzimas aplicadas no ramo da biotecnologia (MORENO et al., 2013). Estas enzimas são úteis aplicações industriais, tais como processamento de alimentos, cervejaria, biocombustíveis, biorremediação etc. Para essas aplicações, torna-se necessário a exploração de novas fontes úteis de enzimas extracelulares fúngicas (REDDY e SREERAMULU, 2012). Neste contexto destacam-se as amilases, essas são carboidrases e possuem a capacidade de hidrolisar ligações glicosídicas presentes nas cadeias de amilose e amilopectina e atuam sobre as ligações α-1,4 e α-1,6 que estão presentes no amido (GUPTA et al., 2003; KOBLITZ, 2008). São classificadas em várias formas, dependendo de como atuam sobre as moléculas de amido (PATHAK e NARULA, 2013). As enzimas amilolíticas apresentam grande importância biotecnológica e formam o principal grupo de enzimas utilizado na indústria de alimentos, são aplicadas nas indústrias de cervejas, bebidas destiladas, panificação, cereais para alimentação infantil, liquefação e sacarificação do amido, além de aplicações em indústrias químicas, têxtis e farmacêuticas (DEB et al., 2013; GUPTA et al., 2003). A partir do presente estudo objetivou-se isolar os fungos filamentosos presentes na fermentação natural do cacau realizada no Município de Tucumã, PA e avaliar o potencial enzimático dos isolados na atividade amilololítica.

Material e métodos

As amostras foram coletadas em Tucumã, município brasileiro do interior do estado do Pará. A coleta foi realizada nos tempos 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de fermentação. De cada tempo foram coletadas três amostras (em cochos distintos) contendo cada uma cerca de 200 g de sementes de cacau, totalizando assim, 24 unidades experimentais com aproximadamente 5 kg. As amostras foram acondicionadas em sacos de polietileno estéreis e transportadas em caixas isotérmicas contendo gelo para o Laboratório de Microbiologia de Alimentos - PPGCTA/UFPA onde foram armazenadas a 4 °C até a realização das análises. Para o isolamento dos fungos filamentosos foram realizadas diluições decimais (10-1 a 10-7) seriadas de alíquotas das amostras de cacau em água peptonada tamponada à 1%. A partir das diluições foi realizado um plaqueamento em Ágar Batata Dextrose (BDA) pela técnica inoculação em superfície. As placas foram incubadas a 30 °C em estufa de crescimento microbiano durante 7 dias (APHA, 2001). Após o período de incubação, os fungos filamentosos que apresentaram características morfológicas macroscópicas (cor, tamanho do micélio e produção de esporos) diferentes foram isolados. O isolamento do fungo foi realizado através de repiques de fragmentos de ágar BDA contendo micélio do fungo até obtenção de culturas visualmente puras. O potencial amilolítico foi avaliado seguindo a metodologia de Khokhar, Mukhtar e Mushtaq (2011) com algumas adaptações. Para isso, o meio ágar sal mineral constituiu de 0,5 g.L-1 de MgSO4.7H2O; 1,0 g.L-1de NaNO3; 1,0 g.L-1 de KH2PO4; 0,01 g.L-1 de Fe2SO4; 20,0 g.L-1 de ágar; e como fonte de carbono utilizou-se amido solúvel (20,0 g.L-1). O pH inicial do meio foi ajustado para 6.0 e posteriormente o meio foi esterilizado em autoclave a 121 °C por 15 minutos. 20 mL do meio foram vertidos em placas estéreis. Cada fungo filamentoso previamente isolado foi repicado para uma placa contendo o meio ágar sal mineral solidificado. As placas foram incubadas em estufa de crescimento microbiano a 30 ºC durante três dias. Percorrido o período de incubação foi realizada a revelação do halo de degradação do amido com solução de lugol. Para isso, foram vertidos 15 mL da solução sobre a superfície das placas e descartados logo após. Posteriormente as placas foram incubadas durante 10 minutos a 30 °C em estufa. A atividade amilolítica foi detectada pela formação de um halo claro circundado por uma zona azulada (DEB et al., 2013). O Índice Enzimático - IE foi obtido mediante a relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio do micélio do fungo filamentoso. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de comparação múltipla de Tukey (p<0,05). As análises estatísticas foram efetivadas utilizando-se o software Statistica versão 10.0.

Resultado e discussão

Foram isolados um total de 25 fungos filamentosos com diferentes características morfológicas macroscópicas. Cada isolado foi codificado em FF (Fungo Filamentoso) + um algarismo numérico. Na Tabela 1 encontram-se os resultados obtidos do potencial enzimático dos fungos filamentosos na atividade extracelular da enzima amilase. Os resultados demostraram que no teste de amilase os fungos filamentosos isolados apresentaram IE’s variados, sendo que os isolados FF04, FF08, FF11, FF17e FF20 não apresentaram potencial enzimático na atividade amilolítica. Conforme Stamford; Araújo e Stamford (1998) um fungo filamentoso para ser considerado um potencial produtor de determinada enzima extracelular ele deve apresentar IE igual ou superior a 2,0, com isso, no apenas os isolados FF05 e FF16 foram considerados potenciais produtores de amilase, sendo o isolado FF16 o que obteve maior IE de acordo com o teste de Tukey. De acordo com Khokhar, Mukhtar e Mushtaq (2011) o teste de amilase para ser considerado positivo, o halo de sacarificação devem apresentar cor clara ou azulada. Conforme pode ser observado na Figura 1, os halos gerados pelos isolados FF05 e FF16 apresentaram as características esperadas. O fungo filamentoso FF16 se destacou na produção de amilase, visto que após 72 horas de incubação houve degradação de todo o amido presente no meio de cultivo. Conforme Khokhar, Mukhtar e Mushtaq (2011) fungos filamentosos são frequentemente utilizados para a produção de enzimas de interesse biotecnológico, pois as produzem em elevados níveis. As amilases apresentam grande importância tecnológica, uma vez que são empregadas na sacarificação do amido, obtendo assim, açucares simples de interesse para a indústria de alimentos. Estudo realizado por Khokhar; Mukhtar e Mushtaq, 2011 relata que amilases de origem fúngica são secretadas principalmente por fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus. Com isso, os dois isolados que apresentaram bom potencial na atividade amilolítica (FF05 e FF16), possivelmente podem ser alguma espécie dos gêneros citados.

(*) Médias seguidas da mesma letra não diferiram estatisticamente em nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey; Fonte: Dados da pesquisa


CON – Placa controle. Fonte: Acervo pessoal

Conclusões

Dos fungos filamentosos isolados da fermentação do cacau em Tucumã, PA e avaliados quanto ao potencial amilolítico, apenas dois isolados apresentam atividade extracelular satisfatória na produção de amilase. Com isso, é importante que sejam realizados estudos futuros visando a identificação desses fungos filamentosos, assim como a extração dessa enzima, uma vez que esta possui ampla aplicação industrial.

Agradecimentos

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES pela concessão da bolsa de estudos e ao Instituto Tecnológico Vale - ITV pelo financiamento do p

Referências

APHA. American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Washington, 2001.

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