PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE OBTIDO POR BACTÉRIA ISOLADA DO EFLUENTE DA INDÚSTRIA PETROLÍFERA

ISBN 978-85-85905-19-4

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Abreu, K. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Soares, D. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ) ; Oliveira, M.R. (UECE) ; Silva, J. (UFC) ; Mendes, J. (UFC) ; Saboya, R.M. (UFC) ; Abreu, K.L. (UECE) ; Davi, D.M. (UECE) ; Romão, A.L. (UECE) ; Alves, C.R. (UECE)

Resumo

Os biossurfactantes são moléculas anfipáticas produzidas por microrganismos, que reduzem tensões superficiais e interfaciais e possuem propriedades de emulsificação. Apresentam vantagens com relação aos surfactantes químicos como a biodegradabilidade e baixa toxicidade. A utilização de bactérias autóctones revela uma opção promissora pois os microrganismos encontram-se adaptados a situações de estresse ambiental. A bactéria em estudo LUB P1 foi isolada do efluente da Refinaria Lubrificantes e Derivados do Nordeste – Lubnor e revelou-se uma cepa promissora na produção de um biossurfactante para remediação de sítios contaminados.

Palavras chaves

biossurfactante; tensão superficial; biorremediação

Introdução

Os biossurfactantes possuem propriedades industrialmente atrativas como também vantagens em comparação aos surfactantes sintéticos. A produção de biossurfactantes em escala industrial requer grandes investimentos, sendo assim, há a necessidade de uma produção e recuperação rentável deste produto. Estas estruturas conferem uma grande variedade de propriedades, incluindo a capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial de líquidos e formar micelas e microemulsões entre duas fases distintas (BANAT et al., 2010). A vantagem mais importante dos biossurfactantes em comparação com os surfactantes químicos é a sua sustentabilidade ecológica. Os biossurfactantes são biodegradáveis e, portanto, os problemas de toxicidade e acumulação nos ecossistemas naturais são minimizados. Nos últimos anos tem crescido as pesquisas para sua produção devido à baixa toxicidade, biodegradabilidade e eficácia na melhoria da solubilidade e biodegradação de compostos hidrofóbicos (Rocha et al., 2014). Algumas aplicações potenciais incluem biorremediação de poluentes insolúveis em água, recuperação avançada de petróleo e uso em setores, como saúde e indústrias de perfuração de petróleo (Banat et al., 2000; WEI & CHU, 1998). Outras aplicações potenciais podem ser encontradas na agricultura, cosméticos, produtos farmacêuticos, detergentes, indústrias de processamento de alimentos, entre outras (Makkar et al., 2002; Nitschke et al., 2011). Apesar das inúmeras vantagens relatadas em literatura aplicações potenciais para os biossurfactantes, a sua aplicação em larga escala é ainda é bastante limitada, devido a diversos fatores, destacando-se dentre eles o seu alto custo de produção. A área de aplicação ambiental, é a que está mais desenvolvida, uma vez que os biossurfactantes aceleram a degradação microbiana de vários óleos, devido a sua capacidade de aumentar a interação interfacial água-óleo e, assim, promovem a biorremediação de águas e solos (BANAT, 1995). Em relação ao uso ligado a indústria petrolífera, os biossurfactantes podem ser aplicados em recuperação avançada de petróleo melhorando a drenagem de óleo em poço, estimulando a liberação de óleo aprisionado por capilares, no molhamento de superfícies sólidas, ajudam reduzir a viscosidade do óleo e petróleo ao ponto de fluidez, reduz a tensão interfacial, dissolvendo o petróleo, dentre diversas outras funções. Os biossrfactantes atuam ainda na como de-emulsificantes de emulsões de óleo, solubilizantes de óleo, redutores da viscosidade e como agente molhante (SINGH et al., 2007). Preventores de emulsão ou desemulsificantes são produtos químicos que, dependendo da sua afinidade, desemulsificam e desestabilizam as emulsões de água em óleo ou de óleo em água. Nas emulsões de água em óleo, os desemulsificantes agem na superfície das gotículas de água, de modo que estas se rompam. Nas emulsões de óleo em água, os aditivos devem ser solúveis na água e agir na superfície das gotículas do óleo emulsionado, fazendo com que se coagulem e se separem da água. Além disso, os métodos físico-químicos como volatilização, fotoxidação, oxidação química e bioacumulação (Zhao et al., 2008) raramente são bem sucedidos na remoção rápida e na limpeza de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Prince, 1997), além destes métodos não serem seguros e possuírem custo elevado quando comparado com a biorremediação. As interações entre os microrganismos, contaminantes e biossurfactantes podem ser interpretadas a partir de uma perspectiva funcional, considerando que a principal função atribuída aos biossurfactantes é seu envolvimento em captação do contaminante (Perfumo et al., 2010). Os biossurfactantes podem promover o crescimento de microrganismos em contaminantes através do aumento da tensão superfícial entre o óleo e água e através da emulsificação. Em função do exposto e no contexto de sustentabilidade, o objetivo do trabalho é produzir um biossurfactante baseado na habilidade dos microrganismos de adaptação às condições de estresse do efluente da Refinaria Lubrificantes e Derivados do Nordeste.

Material e métodos

Microrganismo: As bactérias foram isoladas do efluente da Lubnor em meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar) esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos, lavadas com solução salina 0,9%, colocadas em ependorf e levadas para o banho-maria à 70 0C por cinquenta minutos com o objetivo de selecionar bacilos para a produção do biossurfactante. A manutenção e repique das culturas isoladas, foram feitas em placas petri contendo meio TSA, esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos As placas TSA repicadas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30ºC por 24 horas para obtenção da cultura para realização dos ensaios fermentativos. Inóculo: O meio de propagação do inóculo segue a mesma composição do meio utilizado para produção do biosurfactante, tendo como fonte de carbono 10,0 g/L de glicose em meio mineral com reativos padrão analítico, 1,0 g/L de (NH4)2SO4 como fonte de nitrogênio, 5,0 g/L de extrato de levedura, 6,0g/L de Na2HPO4, 3,0g/L de KH2PO4, 2,7g/L de NaCl e 0,6g/L de MgSO4.7H2O esterilizados a 110°C por 10 minutos. Três alçadas da cultura na fase exponencial de crescimento foram transferidas para frascos de erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL meio de propagação do inóculo, incubado 150 rpm, 30°C por 24 horas em agitador rotatório (Shaker Tecnal TE-480). O inóculo foi ajustado para uma faixa de 0,1 a 0,2 em espectrofotômetro a 600 nm e posteriormente adicionado ao meio de cultivo na proporção de 10% v/v de inóculo. Condução dos ensaios: Os experimentos foram realizados em agitador rotatório (Shaker Tecnal TE-480) por 48 horas em duplicata. Amostras foram retiradas ao final das 48 horas e analisadas posteriormente. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 10.000 g, 5ºC e o sobrenadante livre de células, submetido às análises. Ajustou-se o pH para 7,0 antes da centrifugação para remoção das células, a fim de evitar perdas da surfactina devido a sua precipitação em pH ácido. Análises realizadas: as medidas de tensão superficial foram realizadas em tensiômetro Kruss pelo método de Du Nöuy (Costa et al., 2006). O índice de emulsificação foi determinado de acordo com Cooper e Goldenberg (1987) e Makkar e Cameotra (1997) com pequenas modificações: 2,0 mL do meio de cultura fermentado livre de células foram colocados em tubo de ensaio, com fundo chato e adicionou-se o mesmo volume de diferentes fontes hidrofóbicas (querosene e óleo de soja) para avaliar o poder de emulsificação e estabilidade da surfactina produzida. O colapso da gota foi observado segundo a metodologia de Tugrul e Cansunar (2005) foi adicionado 2mL do meio fermentado livre de células e 2mL de óleo 20W 40. A Quantificação de biossurfactante bruto produzido foi obtido através da acidificação das amostras a pH 3,0 e posterior centrifugação a 10.000 g por 15minutos, o sobrenadante foi descartado e o biossurfactante produzido foi quantificado através do seu peso seco.

Resultado e discussão

A bactéria em estudo foi isolada e selecionada do efluente da Lubnor. A bactéria isolada foi submetida a coloração de Gram e analisada em microscópio ótico. A bactéria LUB P1 foi identificada como Gram + e apresenta características de estreptococus. Na Tabela 1 é possível verificar o resultado da coloração de Gram e as características observadas em microscópio e visualmente. CONCENTRAÇÃO CELULAR E pH O ensaio fermentativo teve duração de 48 horas e 72h, de acordo com a Tabela 2, podemos observar que a concentração de biomassa para 48 horas de fermentação não apresenta diferença significativa do período de 72h, não sendo, portanto, necessário prolongar o período de fermentação para a produção de biomassa. De acordo com a concentração de inóculo a porcentagem ideal é de 5% para produção de biomassa não havendo uma maior produção com o aumento da porcentagem de inóculo. ÍNDICE DE EMULSÃO E COLAPSO DA GOTA Avaliou-se o poder emulsionante do surfactante produzido frente a diferentes fontes hidrofóbicas: óleo de soja e querosene. Adicionou-se 2,0 mL de caldo fermentado livre de células das amostras de diferentes tempos de cultivo e 2,0 mL da fonte hidrofóbica. Agitou-se vigorosamente em vórtex por 2 minutos, deixando em repouso por 24 horas. Após esse período mediu-se a altura total da solução e a altura da fase emulsionada para obtenção do índice de emulsão (IE24) em %. O meio contendo o surfactante foi capaz de emulsionar óleo de soja e querosene. Observou-se um maior poder emulsionante com óleo de soja, com valores em torno de 50%. De acordo com Ioussef et al. (2004), emulsões obtidas acima de 40%, indicam que o microrganismo é um bom produtor de biossurfactante. Todas as concentrações testadas foram capazes de produzir biossurfactantes como representado na Tabela 3, onde podemos demonstrar a produção positiva pelo teste do Colapso da Gota de óleo. Os dados obtidos no presente estudo comprovam os resultados de produção positiva de biossurfactante encontrado por Tugrul e Cansunar (2005), que utilizaram a mesma metodologia para demonstrar a capacidade de produção de biossurfactantes por bactérias. A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos. PRODUÇÃO DE SURFACTANTE A quantificação de surfactante bruto produzido após os ensaios fermentativos de 48h e 72h estão na tabela 4. De acordo com os resultados obtidos é possível verificar que a concentração de 10% no período de 48h apresentou uma melhor produção do surfactante. TENSÃO SUPERFICIAL Um dos critérios utilizados para selecionar microrganismos produtores de biossurfactante é a habilidade em reduzir a tensão superficial abaixo de 40 dina/cm (Pinto, 2009). De acordo com os resultados obtidos na tabela 5, todos abaixo de 40 dina/cm, o microrganismo LUB P1 foi capaz de reduzir a tensão superficial do meio em todas as concentrações avaliadas, logo produziu biossurfactante.

Bactérias, biomassa e pH e Indice de emulsão


Quantificação do surfactante e tensão superficial

Conclusões

O microrganismo indígena LUB P1 isolado do efluente da Lubnor - Ceará possui capacidade para a produção de biossurfactantes. De acordo com os resultados apresentados a bactéria LUB P1, nas três concentrações de inóculo testadas, 5%, 7% e 10% apresentou excelente produção de surfactante. Os resultados obtidos com os microrganismos isolados, revela a necessidade de mais estudos para otimizar a produção a fim de alcançar maiores concentrações do bioproduto obtido. O microrganismo isolado neste trabalho indica uma alternativa promissora em processos de Biorremediação através da produção de biossurfactantes.

Agradecimentos

Agradecimentos a Capes, SisNaBio, Renorbio e UECE.

Referências

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