AVALIAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS DE ATIVAÇÃO PARA IMOBILIZAÇÃO DE LECTINAS EM COLUNAS MONOLÍTICAS SUPERMACROPOROSAS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Tecnológica

Autores

Santos, C.M.S. (UESB) ; Gonçalves, G.R.F. (UESB) ; Gandolfi, O.R.R. (UESB) ; Marques, M.A. (UESB) ; Bonomo, R.C.F. (UESB) ; Santos, L.S. (UESB) ; Fontan, R. (UESB)

Resumo

O escopo do presente trabalho consistiu em ativar criogéis de poliacrilamida com etilenodiamino e dihidrazida adípica a fim de verificar o método capaz de imobilizar maior quantidade da glicoproteína concanavalina, para o uso em técnicas de afinidade adsortiva. Os resultados indicaram que para ambos, não houve imobilização de quantidades expressivas da proteína. Contudo, dentre eles, a ativação por etilenodiamino apresentou melhores resultados. Foi realizada a caracterização das matrizes poliméricas, onde verificou-se que embora a fração de macroporos tenha sido muito baixa (inferior a 5%), houve elevada capacidade de inchamento e grau de expansão na estrutura das matrizes. Apesar de se conseguir imobilizar proteína, os métodos precisam ser otimizados para obtenção de melhores resultados.

Palavras chaves

Adsorção; Proteína; Afinidade

Introdução

As lectinas compõem um grupo diverso de proteínas (glicosiladas ou não) de origem não imunológica que reconhecem e se ligam a carboidratos de maneira estável e reversível, com elevada especificidade, sem modificar suas estruturas (CORREIA, COELHO & PAIVA, 2008). Elas estão largamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em vírus, micro-organismos, plantas, animais vertebrados e invertebrados, seja nas superfícies celulares ou em partículas intracelulares, o que sugere seu papel em funções biológicas básicas, incluindo reguladora, adesiva, de defesa contra agentes patogénicos, e muitos outros (VARKI et al., 2009). Em um organismo, as lectinas encontradas estão normalmente presentes em distintas isoformas, chamadas isolectinas (VAN DAMME et al., 1998). Estas diferem em pequenas variações na estrutura primária e especificidade de ligação, que podem revelar diferenças nas suas atividades biológicas (CAVADA et al., 2001). Portanto, surge daí a necessidade de quando se isolar uma lectina, purificar as isolectinas individuais. Em 1965 Agraw e Goldstein descreveram um método pioneiro de purificação de lectinas baseando-se em cromatografia de afinidade para purificar a lectina concanavalina A (D-glicose específica), eles utilizaram uma coluna Sephadex como fase estacionária. Após a aplicação da amostra na coluna eles recuperaram a concanavalina por eluição com solução de D-glicose. As funções biológicas dessas proteínas ainda não são devidamente conhecidas. Contudo, estudos realizados por colaboradores revelam que lectinas de diferentes especificidades foram imobilizadas sobre suportes inertes, e usadas como matrizes de afinidade para fins variados. Assim, elas têm sido utilizadas em cromatografias de afinidade não só para o isolamento, detecção e purificação de biocompostos, como para caracterização e análise de glicoconjugados (OLAJOS, 2010; CERRADA, et. al., 2010) onde podem ser usadas para explorar superfícies celulares, ligando-se a porção carboidrato de glicoproteínas ou glicolipídeos que se projeta na célula (GHAZARIAN, et al., 2011; NUNES et al., 2012b). Do mesmo modo, a cromatografia de afinidade em colunas com lectinas imobilizadas, tem sido extensivamente utilizada não apenas com propósitos preparativos, de isolamento de glicoproteínas de membrana, como por métodos analíticos para separar glicopeptídeos que diferem pouco na composição e estrutura, purificando esses glicoconjugados, devido à sua especificidade de ligação com carboidratos (HELMHOLZ, et al., 2003; ROSENFELD, et al., 2005; ANIULYTE, et al., 2006; WEN; NIEMEYER, 2007). Nessa técnica, os compostos (com afinidade pelo ligante) são imobilizados em matriz cromatográfica mediante ligação seletiva reversível do ligante com a molécula de interesse (NIVEN, 1995). Dados de pesquisas sobre isolamento e purificação de proteínas utilizavam afinidade de partição como o último passo no processamento, no entanto, estratégias recentes mudaram esse paradigma no sentido de usar a cromatografia de afinidade como uma plataforma de etapa única para detecção e separação molecular (MOSER, HAGE, 2010; DUHITA, et al., 2009). Os criogéis, que consistem em suportes cromatográficos de afinidade, compõe um sistema inter-penetrante polímero-solvente em que macromoléculas interligadas via interações químicas formam macroporos interconectados de tamanhos que variam entre 10 a 100 µm. Estes suportes apresentam-se como excelente material cromatográfico por permitir a captura direta de biomoléculas de extratos brutos não processados ou mesmo de meios de fermentação através do escoamento, sem contudo obstruir a coluna (LOZINSKY et al., 2003). Diante do exposto, o uso de criogéis aplicados à técnica de cromatografia de afinidade, revela-se uma alternativa promissora para captura de lectinas em elevados níveis de pureza. No presente trabalho foi avaliada a imobilização de concanavalina A em matrizes monolíticas supermacroporosas ativadas com etilenodiamina ou dihidrazida adípica, fundamentados na afinidade preferencial da concanavalina em solução para com a matriz sólida e os grupamentos expostos imobilizados da molécula na coluna.

Material e métodos

Materiais Acrilamida (AAm), N,N'-Metilenobisacrilamida (MBAAm), Persulfato de Amônio (APS), N,N,N',N'- Tetrametiletilenodiamina (TEMED) e Alil Glicidil Éter (AGE) e padrão de proteína Concanavalina A (Sigma-Aldrich). Durante os experimentos foram utilizados água deionizada e todos os reagentes químicos de alto grau analítico. Metodologia A produção dos criogéis foi conduzida conforme metodologia proposta por Kumar et al. (2003) adaptada para concentração de 6% (m/v) de monômeros e temperatura de síntese igual a -20°C. Ativação das colunas cromatográficas Foram avaliados 2 métodos de ativação na tentativa de imobilização da concanavalina. Método do Etilenodiamino: A ativação foi iniciada percolando a coluna com 30mL de etanol na vazão de 2mL/min, 30mL de uma solução etanol-água 1:1, e 30mL de água deionizada. Após lavagem, circulou 30mL de tampão carbonato 50mM (pH 9,5), seguido de 40mL de etilenodiamino 0,5M no mesmo tampão em recirculação por 4,5horas. A coluna foi lavada com água até pH neutro, sendo então percolados 30mL de tampão fosfato 0,1M (pH 7,2). Posteriormente, 20mL de solução de concanavalina A (2mg/mL) em tampão fosfato, adicionado de CaCl₂, MnCl₂, MgCl₂, ambos na concentração de 0,1mM e 1% de glicose, recirculou na coluna por 16h. Decorrido o tempo, a coluna foi lavada com 40mL de tampão carbonato, seguido de 30mL de solução de borohidreto de sódio 0,1M no tampão carbonato recirculando por 3,5h, à vazão constante. Feito isso a coluna foi lavada com 100mL de água, depois aplicado 40mL de etanolamina 0,1M em tampão carbonato, e novamente lavada com água, finalizando a ativação circulando o tampão fosfato. Método da Dihidrazida Adípica: O procedimento de lavagem inicial do criogel seguiu o mesmo princípio acima citado para sequência etanol, etanol-água e água. Em seguida, passou-se 40mL de tampão citrato 0,1M (pH 3,0) e 40mL de dihidrazida adípica 0,2M no mesmo tampão recirculando por 4h. As colunas ficaram imersas em repouso à 50°C por 16h. Logo após, foram lavadas com 100mL de água, seguido de 40mL de tampão fosfato 0,1M (pH 7,2) e 20mL da solução de proteína conforme o método anterior. Logo após, foi lavada com 40mL de tampão carbonato 0,05M (pH 9,5) e 40mL de solução de borohidreto de sódio 0,1M em tampão carbonato, com reciclo por 3,5h. Ao fim, a coluna foi lavada com 100mL de água e 40mL de tampão carbonato com etanolamina 0,1M. Finalizando a ativação com mais 100mL de água para retirar o excesso da etanolamina e 40mL de tampão fosfato. Em ambas ativações a quantidade de proteínas imobilizada foi quantificada por diferença da solução de concanavalina recirculante, utilizando-se leitura direta a 280nm em espectrofotômetro. Caracterização dos criogéis A capacidade de inchamento, segundo metodologia proposta por Savina et al., (2005). O grau de expansão, de acordo com o relatado por Fontan (2013) e a fração de macroporos e de sólidos, conforme metodologia proposta por Plieva et al. (2004).

Resultado e discussão

ATIVAÇÃO DOS CRIOGÉIS Os valores adquiridos para a quantidade de proteína imobilizada nas matrizes estudadas, assim como os resultados obtidas na caracterização dos mesmos são apresentados na Tabela 1. As colunas cromatográficas formadas apresentaram estrutura esponjosa, como era desejado, configurando elevada porosidade. Esta característica vai de encontro com o que foi observado por Carvalho et al., (2014) ao produzirem criogéis com semelhantes concentrações de monômeros poliméricos para avaliar o processo de adsorção da proteína lactoferrina nos referidos suportes supermacroporosos. Estas colunas cromatográficas com poros suficientemente grandes podem permitir que soluções contendo fragmentos celulares e materiais particulados em geral possam ser escoados sem provocar sua obstrução (LOZINSKY et al., 2002.) Na área de imobilização de proteínas, a reticulação, tem sido empregada para estabilizar as proteínas e enzimas multiméricas, modificar a superfície dos suportes e ligar covalentemente as enzimas entre si ou na matriz de imobilização (LA ROTTA HERNANDEZ et al., 2005; COWAN; FERNANDEZ-LAFUENTE, 2011). Ao analisar os resultados obtidos pelos agentes de reticulação estudados neste trabalho foi verificado que ambos apresentaram baixa capacidade de imobilização da concanavalina A. Foi possível verificar que a quantidade de proteína encapsulada foi semelhante para cada suporte poroso, com um teor médio final de 18,74 ± 2,69 miligramas de concanavalina por gramas de criogel para ativação com a dihidrazida adípica e 28,52 ± 3,43 miligramas de concanavalina por gramas de criogel para a metodologia com o etilenodiamino. Desta forma, verificou-se que os radicais carbonila e carboxila presentes na proteína parecem apresentar maior afinidade pelo etilenodiamino, havendo uma interação covalente mais estável do que com os grupos hidrazidas do suporte. A relação do conteúdo de proteína imobilizada versus concentração de proteína circulante revelou que a capacidade adsortiva da coluna pode estar diretamente relacionada com a formação e estrutura dos poros após ativação, que a depender da formação estrutural, podem ter os sítios ativos comprometidos pelo tamanho da biomolécula. A partir dos resultados apresentados na tabela 2, verifica-se que a estrutura dos monólitos apresentou-se bastante semelhante, havendo poucas diferenças nos valores de capacidade de inchamento, grau de expansão e fração de macroporos. Verificou-se que os criogéis apresentaram uma massa quando hidratados quase 20 vezes superior ao seu peso desidratado, o que revela muitos espaços vazios na condição de uso. A capacidade de inchamento dos criogéis quando se utilizou o etilenodiamino foi semelhante à encontrada por Savina et al., (2005) em um suporte cromatográfico produzido também com 6% de monômeros. Já nos criogéis ativados com a dihidrazida adípica, a mesma análise teve um resultado um pouco inferior, no entanto também em acordo com vários outros autores que encontraram variações entre 3 e 15 kg/kg (ARVIDSON et al., 2002 e 2003; BERELI et al., 2012; ÇIMEN; DENIZLI, 2012; UYGUN et al., 2012). O grau de expansão e a fração de sólidos também foram semelhantes para os diferentes métodos de ativação empregados. Para a fração de macroporos, foram encontrado valores em acordo com os obtidos por muitos autores na literatura cujos resultados variaram na faixa de 70 a 85% (YAO et al., 2006a, 2006b e 2007). Com relação a fração de sólidos, representada pela fração do polímero seco, verifica-se uma massa muito baixa, porém está em acordo com o encontrado por outros métodos de ativação relatados na literatura.

Fonte: Dados da pesquisa


Fonte: Dados da pesquisa

Conclusões

Apesar da grande diversidade de métodos desenvolvidos e aplicados na imobilização de biomoléculas, não há um método aplicável para todas. Então a partir das informações disponíveis sobre as características das mesmas, tem se tornado possível sugerir técnicas de imobilização e purificação de biocompostos sem comprometer suas características físico-quimicas. Diante do exposto podemos inferir que o processo de imobilização da proteína concanavalina A a partir da ativação do monólito polimérico utilizando-se etilenodiamino ou dihidrazida adípica não apresentaram elevada eficiência, obtendo-se baixos valores de proteína imobilizada, o que nos leva a perceber a necessidade de otimização da técnica, através de melhores condições de temperatura, pH, pressão volumétrica, dentre outros. Podemos concluir também que os diferentes métodos de ativação avaliados pouco afetaram as características avaliadas, sendo que ambos apresentaram elevada capacidade de inchamento e elevada fração de macroporos.

Agradecimentos

Referências

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