DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ADSORVENTES MONOLÍTICOS SUPERMACROPOROSOS RETICULADOS COM GLUTARALDEÍDO E IMOBILIZADOS COM CONCANAVALINA PARA PURIFICAÇÃO DE LECTINAS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Tecnológica

Autores

Santos, C.M.S. (UESB) ; Gonçalves, G.R.F. (UESB) ; Gandolfi, O.R.R. (UESB) ; Marques, M.A. (UESB) ; Bonomo, R.C.F. (UESB) ; Santos, L.S. (UESB) ; Fontan, R.C.I. (UESB)

Resumo

A purificação de biomoléculas com a manutenção de sua bioatividade é de grande interesse das indústrias de alimentos e farmacêutica. A cromatografia de afinidade revela-se uma estratégia propícia para tal purificação e obtenção de biocompostos ativos por não provocar alterações das suas características. O objetivo deste trabalho foi ativar adsorventes monolíticos reticulados com glutaraldeído para imobilizar concanavalina A para a purificação de lectinas por afinidade. Verificou-se que a inserção de braços espaçadores do glutaraldeído permitiu a imobilização de 126,03±18,84mg/g de adsorvente. Foi também realizada a caracterização parcial do adsorvente, verificando-se elevada capacidade de inchamento e fração de macroporos. O monólito revelou-se promissor para purificação de lectinas.

Palavras chaves

cromatografia; glutaraldeído; lectina

Introdução

A demanda da indústria de alimentos e farmacêutica por biocompostos ativos é crescente, buscando-se, portanto, o emprego de técnicas que mantenham ao máximo a bioatividade desses compostos (GUIOCHON e BEAVER, 2011). Logo, o desenvolvimento de novas estratégias de biosseparação e purificação de compostos em extratos de interesse têm se tornado uma necessidade contínua, e os adsorventes e trocadores iônicos surgem como alternativas para tais aplicabilidades. Na vanguarda desse processo está a produção de monólitos, estruturas porosas altamente interconectadas formadas em corpo único, considerados a quarta geração dos materiais cromatográficos (JUNGBAUER e HAHNA, 2008). Essas estruturas são versáteis no seu uso, podendo ser produzidos na forma de colunas, discos ou membranas, e apresentam baixo custo se comparados a matrizes tradicionais na cromatografia (GUIOCHON, 2007). Contudo, apesar das vantagens apresentadas pelos referidos suportes cromatográficos poliméricos, sua estrutura física gera uma área superficial significativamente menor se comparada a de um leito fixo empacotado, razão pela qual sua eficiência pode ser diminuída. Por isso o estudo de modificações na estrutura dos criogéis é uma área essencial e que vem se desenvolvendo rapidamente. Modificações, químicas ou físicas, podem ser feitas visando aumentar a eficiência dos processos de separação (YAO et al., 2007; YUN et al., 2007; WANG et al., 2008). As modificações da superfície do criogel são normalmente realizadas por meio da circulação das soluções contendo os agentes de ativação através da matriz polimérica ou por imersão do suporte na solução contendo os grupos ligantes (KIM; HAGE, 2005). Tem-se então adotado alguns métodos de imobilização de ligantes e biomoléculas para serem empregados nesses criogéis, são eles: Método Epóxi (MALLIK; JIANG; HAGE, 2004), Método da Base De Schiff (MALLIK; JIANG; HAGE, 2004), Método do Carbonildiimidazol (HAGE; CAZES, 2005), Método do Dissuccinimidil Carbamato (HAGE; RUHN, 2005; JIANG; MALLIK; HAGE, 2005), Método de Troca Catiônica (HAHN et al., 1998), Método do Glutaraldeído (LUO et al., 2002), dentre outros. O criogel aldeído-ativado tende a ter uma taxa de imobilização maior do que o método epóxi e alguns dos demais métodos, e devido a um maior espaçamento entre o biocatalisador imobilizado e a superfície do criogel o método tende a ter resultados mais favoráveis na adsorção das biomoléculas. A introdução de braços espaçadores contribui para prevenção dos efeitos de impedimento estérico e limitações difusionais, além de garantir uma distância adicional entre o suporte e a biomolécula, proporcionando uma melhor posição para ação catalítica após imobilização (LUO et al., 2002; KNEZEVIC et al., 2006). É sabido que as lectinas constituem um grupo de glicoproteínas encontrado em muitos organismos, tais como bactérias, plantas e animais (PERÇIN e AKSÖZ, 2012), sendo as sementes de leguminosas a principal fonte (ETZLER, 1986). Para a obtenção das lectinas purificadas, alguns métodos vem sendo avaliados, como a precipitação com etanol, filtração em gel e troca iônica (JUNG et al., 2003; SANTANA et al., 2008), mas a cromatografia por afinidade é a mais efetiva para se obter um grau de pureza mais elevado (PERÇIN e AKSÖZ, 2012). Entre as lectinas, uma das mais empregadas, tem sido a concanavalina A, isolada da leguminosa Canavalia ensiformes. Essa proteína liga-se a moléculas que contêm a α- D -mannopyranosyl, α- D -glucopyranosyl e estruturas estericamente relacionadas, além de se complexar com uma série de substâncias que contenham esses açúcares. Imobilizações com Concanavalina A tem sido extensivamente utilizado para o isolamento, fraccionamento, caracterização estrutural e imobilização de glicoproteínas e outros glicoconjugados biologicamente importantes que transportam radicais glicose e manose (CARLSSON, et al., 1998). Devido à grande aplicabilidade dessa substância, surge a necessidade de maior disponibilidade de mercado e a opção do fornecimento através de fontes naturais renováveis aliadas a técnicas de extração e purificação, razão que se tornou o alvo das nossas atenções, e que justifica o escopo da presente pesquisa. O desenvolvimento de novos adsorventes de menor custo e a utilização de fontes alternativas para a obtenção de lectinas constituem uma potencial iniciativa para a agregação de valor à cadeia produtiva de frutas pouco exploradas e para o incentivo e fortalecimento de outros segmentos industriais, como a indústria farmacêutica e de alta tecnologia associada.

Material e métodos

Materiais Acrilamida (AAm), N,N'-Metilenobisacrilamida (MBAAm), Per-sulfato de Amônio (APS), N,N,N',N'- Tetrametiletilenodiamina (TEMED) e Alil Glicidil Éter (AGE) e Concanavalina A, provenientes da Sigma- Aldrich (Steinheim, Germany). Água ultrapura (sistema Milli-Q Plus) e reagentes químicos de alto grau analítico. Os materiais para execução foram obtidos no Laboratório de Engenharia de Processos (LEP) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, onde o experimento foi realizado. Metodologia Produção do criogel A produção da coluna macroporosa seguiu metodologia proposta por Kumar et al. (2006) e Yao et al. (2006) com adaptações. Os monômeros AAm, MBAAm e AGE foram pesados em balança analítica com concentração de 6% (m/v) e dissolvidos em água. A solução foi homogeneizada em ultrassom por 5 minutos. Foi adicionado 120 μL de APS e 78 μL de TEMED. A solução foi rapidamente vertida em seringas plásticas de 5mL, seladas e imersas em banho termostático de etanol à -20°C por 24h. Decorrido este tempo, as colunas foram transferidas para temperatura de refrigeração por 4h, depois foram alocadas em estufa à 60°C para desidratação até peso constante. Posteriormente, as colunas foram lavadas com 200mL de água e secas em estufa até peso constante. Ativação do monólito Para imobilização da concanavalina A utilizando a técnica do Glutaraldeído como reagente reticulante, foram adotadas as metodologias propostas por Kumar et al. (2003) e Petro et al. (1996) com adaptações. A ativação foi iniciada escoando 30mL de álcool etílico (2mL/min), 30mL de álcool etílico com água na proporção 1:1 e 30mL de água nas mesmas condições de fluxo. Finalizada essa etapa, escoou 30mL de tampão carbonato 50mM (pH 9,5) e 40mL de etilenodiamino (0,5M) no tampão carbonato em recirculação por 4,5h. O criogel foi então lavado com água até pH neutro. Alcançada a condição foi aplicado 30mL do tampão fosfato 0,1M (pH 7,2), 40mL da solução de glutaraldeído (5%) em tampão fosfato (nas mesmas condições de circulação do etilenodiamino). Foi rotacionado 20mL de solução de concanavalina A (2mg/mL) no tampão fosfato, adicionando de CaCl₂, MnCl₂, MgCl₂, ambos na concentração de 0,1mM e 1% de glicose, em recirculação por 16 horas. Logo após, a lectina imobilizada foi quantificada por diferença na solução de concanavalina antes e após recirculação. A leitura foi realizada em espectofotômetro UV visível. Sequencialmente foi aplicado na coluna 40mL de tampão carbonato, 30ml de solução de Borohidreto de sódio (0,1M) em tampão carbonato por 3,5h. A coluna foi lavada com 100mL de água e 40mL de Etanolamina (0,1M) em solução tampão, e novamente lavada com água, finalizando a ativação com 30mL de tampão fosfato. Caracterização A capacidade de inchamento foi realizada segundo Savina et al., (2005); O Grau de expansão, segundo Yao et al. (2006); A Fração de macroporos conforme proposto por Plieva et al. (2004) e a fração de sólidos, segundo Fontan (2013).

Resultado e discussão

A coluna supermacroporosa exibiu características altamente desejáveis, apresentando além da alta porosidade, alta permeabilidade e baixo coeficiente de dispersão axial em uma ampla faixa de velocidade do fluido (PERSSON et al., 2004; YAO et al., 2006). A combinação das propriedades dos monômeros constituintes, conferiu a mesma, boa biocompatibilidade e robustez química e mecânica, abrindo novas perspectivas para a concepção desses materiais macroporosos para utilização em detecção analítica e captura seletiva de moléculas de interesse. Por sua acessibilidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade, hidrogéis de poliacrilamida vem se consolidando como uma das matrizes mais utilizada na preparação de suportes semi- interpenetrante, conseguida através de ligação cruzada de polimerização de acrilamida na presença de polímeros sintéticos ou naturais. Diante do exposto, têm- se descoberto inúmeras aplicações para esses criogéis, bem como, sistemas de administração de fármacos (RISBUD, BHONDE, 2000; EKICI, SARAYDIN, 2004), condicionadores de solo e remediação de águas residuárias (ZOHURIAAN et al., 2010). Com relação a ativação da coluna polimérica com glutaraldeído, podemos inferir que a técnica mostrou-se eficiente, estando em acordo com pesquisadores na literatura (PETRO et al., 1996; LUO et al.,2002), revelando-se desta forma como uma alternativa potencial. Essa inferência partiu-se da constatação pela razão de imobilização equivalente à 126,03 ± 18,84 miligramas de proteína por grama de adsorvente desidratado, valor considerado elevado quando comparado com a mesma coluna sem- ativação, o que nos revela que o glutaraldeído otimiza a capacidade adsortiva do suporte monolítico. O fato do glutaraldeído poder reagir com os grupos amina terminal, grupos hidroxilas e sulfetos, beneficiou significativamente o grau de imobilização da lectina, sendo justificado pela reação com o radical reativo. A ativação do criogel pelo glutaraldeído converte o suporte da estrutura epóxi-ativado para amina-ativado, pela reação dos grupos epóxi com o reagente etilenodiamina (PETRO et al., 1996), este por sua vez reagiu com o dialdeído (glutaraldeído) e produziu uma coluna supermacroporosa aldeído ativado que se ligou aos grupos aminas das lectinas, formando uma base de Schiff. Em seguida, ocorreu a redução e estabilização dessa base de Schiff por meio do uso de um agente redutor. Devido a um maior espaçamento entre o biocatalisador imobilizado e a superfície do criogel, este método de imobilização revelou-se útil para evitar efeitos de impedimento estérico (LUO et al., 2002). Em outras palavras, o uso dos braços espaçadores durante ativação do criogel beneficiou o processo adsortivo, uma vez que este abriu novas possibilidades de sítios de ligação, com maiores distância entre eles, não comprometendo desta forma, a ligação das biomoléculas de interesse a coluna supermacroporosa. Os resultados obtidos a partir das análises de caracterização das colunas monolíticas supermacroporosas são apresentadas na Tabela 1. Verificou-se que os monólitos ativados com o glutaraldeído apresentaram resultados diferentes quando comparado a monólitos semelhantes não-ativados. A presença dos braços espaçadores ligados a estrutura supermacroporosa influenciou a capacidade de inchamento e a fração de macroporos dos suportes cromatográficos, contudo os resultados apresentados estão em acordo com outras metodologias de ativação de criogéis encontradas na literatura, onde verificou-se uma faixa com variação entre 3 a 15 kg/kg para a capacidade de inchamento dessas colunas. Esse parâmetro refere-se a medida do grau de hidratação da matriz de criogel, assim quanto maior esse valor, maior a tendência deles serem mais maleáveis (após inchamento) e, provavelmente, menores pressões suportariam (CARVALHO, 2010), ou seja, o fato de ter uma capacidade de inchamento reduzida após ativação beneficiou ao suporte cromatográfico, uma vez que a reação química do grupo amina do suporte macroporoso reagindo com os aldeídos do glutaraldeído conferiu uma estrutura mais rígida e consequentemente maior resistência a deformação. Savina et al, (2005) observou em seu experimento que após a ativação, a capacidade de inchamento foi menor para o criogel ativado quando comparado ao criogel sem ativação. No entanto, este mesmo autor obteve valores superiores (18 kg/kg) quando comparados com os resultados obtidos no presente experimento, 14, 15 kg/kg. Outros autores relatam ainda valores menores para a capacidade de inchamento dos criogéis produzidos, contudo torna-se válido ressaltar que nestes, as concentrações de monômeros também foram inferiores, variando entre 2,8 a 6 g/g (ARVIDSSON et al, 2003; ARVIDSSON et al, 2002; ERGÜN et al, 2007; DERAZSHAMSHIR et al, 2008). Na análise do grau de expansão, que consiste na relação entre a massa do criogel seco, em condição de armazenamento e o volume que o mesmo ocupa em condições operacionais, assim como na avaliação da fração de sólidos, que representa a fração do polímero seco, não foi verificado alterações significativas quando comparado com outros métodos de ativação. Os resultados foram bastante próximos revelando-nos que após saturação da coluna cromatográfica, o comportamento da mesma no deslocamento do volume é semelhante à ativação por outros reagentes reticulantes e métodos de ativação que não formam braços espaçadores como o glutaraldeído. Para a fração de macroporos, 67%, foi encontrado um percentual inferior a faixa delimitada por outros autores que trabalham com criogéis preparados com os mesmos compostos, no entanto, por vezes com concentrações diferentes e métodos de ativações diferentes (YAO et al, 2006a; YAO et al, 2006b; YAO et al, 2007a; YAO et al, 2007b; CARVALHO, 2010; YAN et al, 2011). Estes autores referenciam a faixa padrão variando entre 70 a 85%. Esta variação pode ocorrer devido à variação dos cálculos realizados, onde esses autores consideram a água presa no interior dos microporos e a água livre nos macroporos como uma única análise de porosidade, retirando-a de forma mecânica (espremendo o criogel) e a do interior dos microporos por meio do vácuo, (FONTAN, 2013), o que não foi realizado no presente trabalho.

Fonte: Dados do experimento

Conclusões

Os resultados encontrados são positivos e promissores, visto que, a estratégia de imobilização por colunas supermacroporosas revelou-se alternativa viável na biotecnologia para purificação de biomoléculas em compostos ativos, por provocar pouca alteração na estrutura conformacional destas, conservando sua bioatividade, uma vez que a molécula é espontaneamente imobilizada em uma orientação que lhe é preferencial e energeticamente favorável. Foi verificado também que a inserção de braços espaçadores ao suporte cromatográfico otimiza sua capacidade adsortiva, uma vez que este tem reduzido os efeitos de impedimento estérico, aumentando consequentemente a capacidade de ligação dos biocompostos a serem imobilizados. Diante de tal constatação, podemos concluir que os adsorventes monolíticos produzidos, ativados com o glutaraldeído e tendo a concanavalina A imobilizada, apresentaram potencial para o processo de purificação de lectinas por técnicas cromatográficas de afinidade, e revelaram também satisfatórias características estruturais.

Agradecimentos

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