Identificação de ácido rosmarínico em extrato vegetal por CL-RMN.

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Produtos Naturais

Autores

Macedo Lessa dos Santos, P. (UFRJ) ; Mendes da Silva, J. (UFRJ) ; Conrado Lopes, R. (UFRJ) ; Wanderley Tinoco, L. (UFRJ) ; de Souza, J.E. (UFRJ)

Resumo

O presente trabalho visou o estudo da espécie vegetal brasileira Varronia curassavica Jacq. (Boraginaceae) cujas sinonímias botânicas são Cordia verbenacea DC. e Cordia curassavica (Jacq.) Roem. Esta espécie tem uso popular, principalmente pela população caiçara, como remédio caseiro. Vegeta na região de Cabo Frio, Rio de Janeiro, onde pode ser encontrada próxima às praias e na beira das estradas. Pelo seu uso popular como remédio caseiro, foi introduzida na Relação Nacional de Plantas de Interesse ao Sistema Único de Saúde – RENISUS com o nome de Cordia verbenacea.

Palavras chaves

Varronia curassavica; CL-RMN; ácido rosmarínico

Introdução

Em estudo anterior de nosso grupo de pesquisa sobre a espécie vegetal Varronia curassavica Jacq. (Boraginaceae), cujas sinonímias botânicas são Cordia verbenacea DC. e Cordia curassavica (Jacq.) Roem., foi realizada a determinação do teor de fenóis totais, de flavonoides totais, a atividade antioxidante frente ao radical DPPH e a determinação do perfil químico por CLAE-DAD [1]. Com base nesses resultados, a análise por CL-RMN otimizou a avaliação do extrato em acetato de etila (VCA), o que apresentou melhor atividade antioxidante, reduzindo o tempo de análise e custo de material. A identificação de substâncias por técnicas hifenadas, como a CL-RMN, tem a vantagem de se evitar todo um trabalho de isolamento de uma substância já conhecida na literatura científica, o que se chama de desreplicação [2]. A análise por CLAE-DAD do extrato em acetato de etila (VCA) apontou para um pico muito intenso em 28 min cujo espectro de UV apresentou um máximo de absorção em 330 nm com um ombro em 290 nm. A análise por CL-RMN deste pico, gerou um espectro de RMN de 1H onde foi possível observar sinais na região de hidrogênios aromáticos/olefínicos (7,5 a 6,0 ppm) e um sinal (dubleto) em 4,8 ppm. O padrão de sinais de 1H, assim com o perfil de UV do pico cromatográfico e dados de RMN 1H e UV da literatura [3,4] foi relacionado ao fenilpropanóide ácido rosmarínico, um derivado do ácido cafeico que é encontrado em espécies da família Boraginaceae.

Material e métodos

Preliminarmente foi realizada uma análise por CLAE-DAD para verificar o perfil cromatográfico da amostra no equipamento de análise. O extrato VCA foi solubilizado em MeOH a uma concentração de 20 mg/mL, filtrada em filtro Whatman Uniflo 0,45 µm PVDF e submetida à análise por HPLC em coluna RP 18 Kromasil, 250 mm x 4,5 mm, 100 µ, volume de injeção de 20 µL, fluxo 1 mL/min. Como fase móvel utilizou-se o sistema H2O:AcOH a 0,1% (A) e MeOH (B) na seguinte programação: 1-20 min (40% B), 24 min (45% b), 30 min (50% B), 35 min (55% de B), 40 min (60% de B), 60 min (100% B), 80 min (40% de B), 81 stop. O MeOH utilizado foi em grau espectroscópico (TEDIA) e a água MilliQ. Após a análise por CLAE-DAD, o sistema cromatográfico foi conectado ao equipamento de ressonância magnética nuclear para a análise por CL-RMN. Para a obtenção de sinais de RMN mais intensos a amostra VCA foi preparada a uma concentração superior, 60 mg/mL em MeOH, filtrada em filtro Whatman Uniflo 0,45 µm PVDF e submetida à análise por CL-RMN em coluna RP 18 Kromasil, 250 mm x 4,5 mm, 100 µ, volume de injeção de 60 µL, fluxo 1 mL/min. Como fase móvel utilizou-se o sistema H2O:AcOH a 0,1% (A), D2O (B) e MeOH (C) na seguinte programação: 1-20 min (50%A, 10%b, 40%C), 25 min (45%A, 10%B, 45%C), 30 min (40%A, 10%B, 50%C), 35 min (35%A, 10%B, 55%C), 40 min (30%A, 10%B, 60%C), 60 min (100%C). As análises foram feitas em um espectrômetro de RMN a 499,78 MHz para 1H com uma sonda de fluxo de 60 uL. Os espectros de RMN de 1H foram adquiridos usando a sequência WET para a supressão dos sinais dos solventes, com um número de acumulações (scans) em 2048. Os espectros foram processados utilizando-se o programa MestReNova.

Resultado e discussão

A análise por CLAE-DAD do extrato VCA apontou para um pico muito intenso em torno de 28 min cujo espectro de UV apresentou um máximo de absorção em 330 nm com um ombro em 290 nm. Este extrato foi escolhido para análise por técnicas cromatográficas e espectroscópicas pelo fato de apresentar perfil cromatográfico semelhante ao extrato obtido sob as mesmas condições procedimentais e que apresentou a melhor atividade antioxidante frente ao radical DPPH em trabalho recém-publicado por nosso grupo de pesquisa. A análise prévia por CLAE-DAD foi necessária para se observar o perfil cromatográfico da amostra e, assim, proceder à análise por CL-RMN, de forma a selecionar os picos de interesse para a aquisição dos espectros de hidrogênio. O número de acumulações (scans) necessárias para a geração de picos cromatográficos de boa resolução, foi feito entre 60 a 102 min. A alta concentração da amostra, 60 mg/mL que correspondeu a 3,6 mg/mL numa injeção de 60 µL, foi necessária para a obtenção de espectros de boa qualidade uma vez que a RMN não é uma técnica sensível, necessitando de uma quantidade significativa de amostra. A análise por CL-RMN do pico correspondente ao da análise prévia por CLAE- DAD, gerou um espectro de RMN de 1H onde foi possível observar sinais na região de hidrogênios aromáticos/olefínicos (7,5 a 6,0 ppm) e um sinal (dubleto) em 4,8 ppm. O padrão de sinais de 1H, assim com o perfil de UV do pico cromatográfico e dados de RMN 1H e UV da literatura foi relacionado ao fenilpropanóide ácido rosmarínico, um derivado do ácido cafeico que é encontrado em espécies da família Boraginaceae. A ampliação do espectro de 1H mostrou nitidamente os sinais dos dois hidrogênios olefínicos (δ 7.3, d, j = 16 Hz, H-7’; δ 6.1, d, j = 16 Hz, H- 8’).

Conclusões

A análise por CL-RMN do extrato VCA, rico em fenóis e flavonóides, indicou o ácido rosmarínico como o pico cromatográfico mais intenso no extrato. Utilizando-se princípios de desreplicação em análise fitoquímica foi possível evitar o uso de procedimentos cromatográficos preparativos que requerem mais material e aparatos laboratoriais, tempo de análise e uso de solventes em maior escala.

Agradecimentos

À Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa - FAPERJ - pelo apoio financeiro.

Referências

[1]Santi, M.M.; Sanches, F.S.; Silva, J.F.M.; Santos, P.M.L. Determinação do perfil fitoquímico de extrato com atividade antioxidante da espécie medicinal Cordia verbenacea DC. por HPLC-DAD. Rev Bras Pl Med, v.16, n.2, p.256-261, 2014.
[2]Exarchou, V.; Krucker, M.; van Deek, T. A.; Vervoort, J.; Gerothanassis, I. P.; Albert, K. LC-NMR coupling technology: recent advancements and applications in natural products analysis. Magn. Reson. Chem, (43): 681-687, 2005.
[3]Ticli, F.K.; Hage, L.I.S.; Cambraia, R.S.; Pereira, P.S.; Magro, A. J.; Fontes, R.M.; Stábeli, R.G.; Giglio, J.R.; França, S.C.; Soares, A.M.; Sampaio, S.V. Rosmarinic acid, a new venom phospholipase A2 inhibitor from Cordia verbenacea (Boraginaceae): antiserum action potentiation and molecular interation. Toxicon, v. 46, p. 318-327, 2005.
[4]Abedini, A.,Roumy,V., Mahieux, S.,Biabiany, M., Standaert-Vitse, A.,Céline Rivière, C.,Sahpaz,S.,Bailleul,F.,Neut,C.,Hennebelle, T. Rosmarinic Acid and Its Methyl Ester as Antimicrobial Components of the Hydromethanolic Extract of Hyptis atrorubens Poit. (Lamiaceae)Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, v. 2013.