Aplicação da análise multivariada de dados de espectrometria de massas em amostras de glicerol biotransformadas por fungos filamentosos.

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Souto, A.L. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; de Araújo, K.P. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; da Silva, R.M.C. (UNB) ; Pereira, C.B. (UNB) ; Poletto, C.M. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Ribeiro, J.A.A. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Damaso, M.C.T. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Rodrigues, C.M. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Abdelnur, P.V. (EMBRAPA AGROENERGIA)

Resumo

Amostras de glicerol (coproduto da produção de biodiesel) bioconvertido por fungos filamentosos foram analisadas por fingerprinting MS, utilizando espectrometria de massas por infusão direta. A fim de se obter uma melhor interpretação dos dados obtidos pela análise espectrométrica, foi realizada a análise quimiométrica de todos os íons das amostras, utilizando-se a análise de componente principal como método estatístico. Desta forma, pôde-se perceber que as amostras biotransformadas pelos fungos codificados como “PV”, “7”, “25/13” , “24”, “DE155”, “DE165” e “49/11” produziram compostos que os diferenciavam dos demais, representado pelos íons sodiados de m/z 145, 205 e 215, correspondentes a polióis do tipo C4, C5 e C6, os quais podem corresponder a compostos de maior valor agregado.

Palavras chaves

Quimiometria; PCA; Fingerprinting MS

Introdução

O biodiesel é um biocombustível obtido através da reação de transesterificação de óleos vegetais ou gordura animal com etanol ou metanol, na presença de um catalisador alcalino. Nesta reação, o glicerol é produzido como coproduto do biodiesel na proporção de 10 % (v/v) (SILVA et al, 2009). Recentemente, a produção de glicerol aumentou significativamente devido a produção de biodiesel em muitos países, reduzindo drasticamente o preço deste coproduto no mercado (DHAMARDI et al, 2006). A fim de incrementar a cadeia produtiva de biodiesel, a indústria biotecnológica tem investido em tecnologias capazes de bioconverter o glicerol, matéria-prima ou bloco de construção de baixo valor agregado, em produtos de maior valor agregado (BOZELL e PETERSEN, 2009). O potencial de bioconversão do glicerol em produtos de alto valor agregado tem sido demonstrado na indústria de polímeros (produção de 1,3-propanodiol), cosmética (produção de diidroxiacetona), indústria alimentícia e farmacêutica (produção de ácido succínico e ácido cítrico) (RAHMAT et al, 2010). Diante dessas premissas, o objetivo deste trabalho foi realizar um screening de microrganismos capazes de biotransformar o glicerol, por meio de análise de produtos de bioconversão via espectrometria de massas aliado a análise multivariada de dados.

Material e métodos

As amostras de bioconversão do glicerol produzidas, em duplicatas, por fungos filamentosos de diversas espécies foram primeiramente homogeneizadas em vortex por 10 segundos. Em seguida, foram diluídas em vials de 1,5 mL, na proporção de 1 µL de amostra para 1000 µL de metanol:água (1:1). Posteriormente, foram analisadas por espectrometria de massas por infusão direta (DIMS – direct infusion mass spectrometry), utilizando um espectrômetro de massas com fonte de ionização por eletrospray e analisador TOF (time of flight) (Maxis 4G, Bruker, Daltonics). As análises foram realizadas em modo positivo (ESI(+)-MS) utilizando formiato de sódio como calibrante. As amostras foram injetadas em duplicata, para verificar a reprodutibilidade das análises. O tempo total de análise de cada amostra, incluindo o branco, calibrante e amostra, foi de cinco minutos por injeção. O pré-processamento dos dados de espectrometria de massas das amostras analisadas foi executado pelo software “Profyle Analysys” 2.1 (Bruker Daltonics), o qual realizou a calibração por HPC (High Precision Calibration) e normalização pelo maior valor do bucket analisado. A faixa de íons de interesse explorado foi de m/z 70 a 1000, os quais foram analisados entre 1,3 e 3,5 minutos de corrida. Os dados tratados foram exportados no formato ASCII para o software “The Unscrumbler” 10.0 (CAMO Process) a fim de realizar a quimiometria por meio da análise de componente principal (PCA).

Resultado e discussão

Segundo a análise de componente principal dos dados analisados, foi possível observar e analisar 71% dos dados, utilizando apenas o PC1 e o PC2. Ao comparar o gráfico de loadings com o gráfico de scores (Figuras 1 e 2), percebeu-se que as amostras obtidas utilizando-se os fungos “PV”, “7”, “25/13”, “24”, “DE155”, “DE165” e “49/11” produziram compostos que as diferenciavam das demais, representado pelos íons sodiados: m/z 145, 205 e 215. Esse resultado pôde ser verificado ao comparar o quadrante direito de ambos os gráficos. A base de dados indica que os compostos são polióis do tipo C4 (treitol/eritritol), C5 (xilitol/arabitol/ribitol) e C6 (dulcitol/manitol/sorbitol/iditol). Métodos cromatográficos serão utilizados para identificação dos polióis produzidos por cada fungo filamentoso.

Gráfico de scores, representando as amostras de glicerol bioconvertidas por fungos filamentosos


Gráfico de loadings, representando a massa dos compostos produzidos pelos fungos filamentosos

Conclusões

A ferramenta estatística “The Unscrambler” e o método de análise de componente principal (PCA), aplicados à análise de dados de DIMS obtidos de amostras de glicerol bioconvertidas por fungos filamentosos, possibilitou diferenciar a produção de polióis por parte dos fungos avaliados. O uso em conjunto destas metodologias torna-se muito útil para o screening eficiente de microrganismos, assim como para identificação de compostos alvo em experimentos que envolvem bioconversão de blocos de construção como o glicerol.

Agradecimentos

A CAPES pela bolsa de Pós-doutorado, ao CNPq pelo apoio financeiro e à Embrapa pela estrutura laboratorial fornecida.

Referências

BOZELL, J.J.; PETERSEN, G. R. Technology development for the production of biobased products from biorefinery carbohydrates – the US Department of Energy´s “Top 10” revisited. Green Chemistry, nº 12, 539 – 554, 2010.

DHAMARDI, Y.; MURARKA. A.; GONZALEZ. R. Anaerobic fermentation of glycerol by Escherichia coli: a new platform for metabolic for metabolic engineering. Biotechnology and Bioengineering, nº 94, 821 – 829, 2006.

RAHMAT, N.; ABDULLAH, A. Z.; MOHAMED, A. R. Recent progress on innovative and potential technologies for glycerol transformation into fuel additives: A critical review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, nº 14, 987 – 1000, 2010.

SILVA, G. P.; MACK, M.; CONTIERO, J. Glycerol: A promising and abundant carbono source for industrial microbiology. Biotechnology Advances, nº 27, 30-39, 2009.