Desenvolvimento de Método Analítico por GC-MS para Identificação de Metabólitos da Via de Fermentação de Xilose

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Pereira de Araujo, K. (UNIVERSIDADE DE BRASILIA; EMBRAPA AGROENERGIA) ; Verardi Abdelnur, P. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Ghiselli, G. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Pinto Kalil G. Costa, P. (EMBRAPA AGROENERGIA) ; Gonçalves Campos, C. (EMBRAPA AGROENERGIA)

Resumo

O desenvolvimento de métodos analíticos para identificação e quantificação de metabólitos presentes em uma via metabólica é crucial para o estudo do metaboloma de uma espécie, como as leveduras. Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um método analítico para identificação de metabólitos da via de fermentação da xilose, utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Diferentes condições experimentais foram testadas, considerando proporção amostra (padrões) e reagentes derivatizantes. O melhor resultado foi obtido na condição de derivatização cuja proporção da mistura dos padrões e reagentes derivatizantes adicionados foram 40:10:20, respectivamente. No total, 9 metabólitos foram detectados pelo método desenvolvido por GC-MS.

Palavras chaves

metabolômica; GC-MS; leveduras

Introdução

O etanol de segunda geração (2G) é um biocombustível proveniente de biomassas lignocelulósicas, como o bagaço da cana-de-açúcar (SOCCOL et al., 2010). Entretanto, o microrganismo mundialmente utilizado na indústria sucroalcooleira, a levedura Saccharomyces cerevisiae, é incapaz de converter em etanol pentoses presentes nestas biomassas, como a xilose. A xilose corresponde a aproximadamente 33% dos açúcares presentes no bagaço de cana, portanto, o aproveitamento deste açúcar, aumentaria a produção de etanol, a partir da mesma biomassa (FERREIRA-LEITÃO et al. 2010). Diante deste cenário, busca-se identificar leveduras capazes de fermentar xilose, e também, melhorar geneticamente a Saccharomyces cerevisiae para a fermentação deste açúcar. Assim, é fundamental determinar alvos metabólicos, e consequentemente os genes, que estejam diretamente relacionados à conversão de xilose em etanol, para posterior melhoramento genético da levedura. A metabolômica é uma ferramenta capaz de determinar metabólitos em um sistema biológico (DUNN & ELLIS, 2005), sendo uma estratégia interessante para a determinação dos alvos metabólicos. No entanto, a metabolômica envolve diversas etapas, desde o preparo das amostras (quenching e extração), análise dos metabólitos, e processamento dos dados (ABDELNUR et al., 2014). O desenvolvimento de métodos analíticos para a identificação e quantificação de metabólitos presentes em uma via metabólica é crucial para o estudo do metaboloma de uma espécie, como as leveduras. Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um método analítico para identificação de metabólitos da via de fermentação da xilose, utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS).

Material e métodos

Foram preparadas 21 soluções-padrão com concentração de 20 mM em metanol, a saber: ácido acético; ácido α-cetoglutárico; ácido D-málico; ácido oxaloacético; ácido succinico; acetaldeído; D-glicose; D-xilose; D-eritrose- 4-fosfato; D-frutose-6-fosfato; D-glicose-6-fosfato; diidroxiacetona fosfato; DL-gliceraldeído-3-fosfato; D-ribose-5-fosfato; D-xilulose; etanol, fosfoenolpiruvato de potássio, glicerol, piruvato de sódio, succinato de dietila e xilitol. A partir destas soluções, preparou-se uma solução estoque da mistura na concentração de 1 mM em MeOH. Três diferentes condições foram avaliadas na reação de derivatização, considerando-se as proporções, em volume, do mix, cloridrato de metoxilamina e MSTFA: (1) 3:10:20; (2) 20:10:20; (3) 40:10:20. A condição (1) corresponde à adição de 15 μL da solução "mix" em tubo eppendorf, a qual foi inserida em um concentrador de amostras a vácuo Centrivap (Labconco) até evaporação. Em seguida, adicionou-se 50 μL de cloridrato de metoxilamina 20 μg/mL em piridina, por 90 min a 30°C em banho termostatizado. Por fim, adicionou-se 100 μL de MSTFA, por 30 min a 37°C, no mesmo banho. Para as condições (2) e (3) foram variados os volumes da solução “mix”, adicionando-se 100 μL e 200 μL, respectivamente. O extrato derivatizado foi injetado em um sistema GC-MS (modelo QP2010, Shimadzu), com coluna capilar Restek Rtx®-5MS 30mx0,25mm nas condições: gás hélio com fluxo de 1 mL/min, temperatura do injetor 230°C, temperatura da coluna 80°C por 2 min, 15°C/min até 320°C, 320°C por 2 min, volume de injeção de 1 μL, modo split (1:25), temperatura da interface 250°C, temperatura da fonte de ionização 200°C, corte de solvente 4 min, detecção no modo varredura (SCAN) com m/z 85-500.

Resultado e discussão

Devido à polaridade dos padrões analisados, foi necessário realizar a etapa de derivatização para posterior análise por GC-MS. Diferentes condições experimentais foram testadas, considerando proporção amostra (padrões) e reagentes derivatizantes. Nos cromatogramas das amostras injetadas (padrões nas condições 1, 2 e 3), verificou-se a presença de diversos metabólitos da via de fermentação da xilose, identificados como derivados TMS (trimetilsilil). Os principais metabólitos detectados e identificados pertencem às classes dos açúcares, álcoois, aldeídos e ácidos carboxílicos, tais como o glicerol (GRL), ácido succínico (SUCC), ácido DL-málico (MAL), ácido propanóico (PROP), xilitol (XTL), glicose (GLI), D-ribose-5-fosfato (RIB-5-FOS), D-glicose-6-fosfato (GLI-6-FOS) e D-frutose-6-fosfato (FRU-6- FOS). Os melhores resultados foram obtidos na condição de derivatização (3) (Figura 1) cuja proporção da mistura dos padrões (mix) e reagentes derivatizantes adicionados foram 40:10:20, respectivamente.

Cromatograma obtido na condição otimizada (3) por GC-MS.

Conclusões

Três condições experimentais foram testadas, sendo que a condição (3) apresentou o melhor resultado, uma vez que os picos apresentaram maiores intensidades comparados com as demais condições. No total, nove metabólitos foram detectados pelo método desenvolvido por GC-MS neste trabalho. As próximas etapas serão desenvolver um método quantitativo e analisar amostras de leveduras fermentadoras de xilose.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Universidade de Brasília e a Embrapa pelo apoio financeiro.

Referências

ABDELNUR, P.V; CALDANA, C.; MARTINS, M.C.M. Metabolomics Applied in Bioenergy. Chemical and Biological Technologies in Agriculture 1(22), p.1-9, 2014.
DUNN, W. B.; ELLIS, D. I. Metabolomics: Current analytical platforms and methodologies. Trends in Analytical Chemistry, Amsterdam, v. 24, p. 285-294, 2005.
FERREIRA-LEITAO, V.; PERRONE, C. C.; RODRIGUES, J.; FRANKE, A. P. M.; MACRELLI, S.; ZACCHI, G. An approach to the utilisation of CO2 as impregnating agent in steam pretreatment of sugar cane bagasse and leaves for ethanol production. Biotechnology for Biofuels, London, v. 3, n. 7, p. 2-8, 2010.
SOCCOL, C. R.; VANDENBERGHE, L. P. S.; MEDEIROS, A. B. P.; KARP, S. G; BUCKERIDGE, M.; RAMOS, L. P.; PITARELO, A. P.; FERREIRA-LEITÃO, V.; GOTTSCHALK, L. M. F.; FERRARA, M. A.; BOM, E. P. S.; DE MORAES, L. M. P.; ARAÚJO, J. A., TORRES, F. A. G. Bioethanol from lignocelluloses: Status and perspectives in Brazil. Bioresource Technology, Essex, v. 101, p. 4820-4825, 2010.