Determinação simultânea de biomarcadores de função renal em urina utilizando dispositivo analítico microfluídico em papel

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Analítica

Autores

Rossini, E.L. (INSTITUTO DE QUÍMICA - UNESP) ; Milani, M.I. (INSTITUTO DE QUÍMICA - UNESP) ; Pezza, L. (INSTITUTO DE QUÍMICA - UNESP) ; Pezza, H.R. (INSTITUTO DE QUÍMICA - UNESP)

Resumo

O presente trabalho apresenta uma nova metodologia para análise simultânea de creatinina e ácido úrico em urina utilizando μPAD. A análise de creatinina se baseia no método de Jaffé e o do ácido úrico na determinação indireta de Fe(II) por complexação com a 1,10-fenantrolina, ambos com detecção colorimétrica por imagem digital. Após a otimização das condições experimentais realizadas com auxílio de ferramentas estatísticas, foram construídas as curvas analíticas para os analitos, apresentando faixa linear de trabalho de 50 a 600 mg/L com R² de 0,998 para creatinina e de 50 a 500 mg/L com R² de 0,997 para ácido úrico. O método foi aplicado em amostras de urina sintética e os valores encontrados estão próximos dos obtidos pela metodologia comparativa.

Palavras chaves

Creatinina; Ácido úrico; µPAD

Introdução

Os rins têm funções que podem ser classificadas como excretora, reguladora e endócrina. Quando os rins perdem a sua função caracteriza-se a insuficiência renal, podendo ser aguda ou crônica (IRC), sendo a IRC um problema importante de saúde pública, pois sua incidência tem aumentado de maneira acelerada nas últimas décadas e o tratamento é de alto custo e complexidade. A IRC é uma doença silenciosa que não causa sintomas, sendo que a única forma de saber do funcionamento dos rins é pela dosagem de biomarcadores (CHAVES et al, 2002). A creatinina (CRN) é formada no processo de contração muscular. A reação de Jaffé é a metodologia mais utilizada para sua análise por ser simples, rápida, barata e de fácil execução. Através dessa reação, o picrato alcalino reage com a CRN produzindo um produto de coloração alaranjada. O ácido úrico (AU) é formado a partir do metabolismo das bases purínicas e por ser um composto pouco solúvel, sua deposição nas juntas das extremidades ou em outros tecidos moles gera o caso clínico conhecido como gota (MOTTA et al, 2003). O AU tem capacidade de reduzir íons Fe(III) a Fe(II) e este pode ser determinado pela reação colorimétrica com 1,10–fenantrolina. A concentração desses analitos é utilizada como marcador clínico para avaliar a função renal. Dada a importância da dosagem de creatinina e ácido úrico o presente trabalho contribui com o desenvolvimento de dispositivos analíticos microfluídicos em papel (µPAD) para determinação desses analitos, os quais apresentam diversas vantagens, dentre elas pode-se citar baixo custo, fácil obtenção, portabilidade, é compatível com amostras biológicas, requerem pequeno volume de amostra, biodegradável, de fácil incineração e ambientalmente amigável (MARTINEZ et al, 2010).

Material e métodos

A fabricação dos µPAD e dos spot-test com barreiras hidrofóbicas foi realizada com auxílio de uma impressora à cera e posterior aquecimento a 120 ºC por 2 min em estufa. A otimização das condições experimentais foi realizada utilizando ferramentas estatísticas como o planejamento fatorial do tipo 2³ e posteriormente, o planejamento de superfície de resposta, com auxílio do software Statistica 7. Os fatores utilizados no planejamento para a reação com a creatinina foram: [ácido pícrico], [OH^-] e tempo de aquecimento; para a reação do ácido úrico foram: [Fe(III)] (em H₂SO₄ 0,25 mol/L), [1,10–fenantrolina] (em NaOAc 0,529 mol/L) e tempo de aquecimento. Para o aquecimento do meio reacional foi utilizado um secador de cabelos. Os dois fatores de maior influência foram utilizados no planejamento da superfície de resposta. Com as condições experimentais ótimas para os dois analitos foram construídas suas respectivas curvas analíticas. As análises são feitas transferindo-se 10 µL da solução de padrão para uma placa de petri e permitindo que o dispositivo analítico entre em contato com a solução e, após o preenchimento dos canais hidrofílicos, o dispositivo foi aquecido por 50 s. Depois de 10 minutos o µPAD foi digitalizado no scanner da impressora multifuncional HP F2050. As imagens digitalizadas foram tratadas, com auxílio do software livre ImageJ, utilizando o canal verde do histograma RGB. A metodologia foi aplicada a amostras de urina sintética, preparadas como descrito na literatura (LAUBE et al, 2001). Os resultados obtidos foram confrontados com os obtidos pela metodologia comparativa por HPLC-DAD, descrita na literatura (XIANG et al, 2014).

Resultado e discussão

O planejamento experimental demonstrou que para determinação da CRN os dois fatores de maior influência na reação são [OH-] e tempo de aquecimento, cujos valores ótimos foram de 0,437 mol/L e 53,3s. Após testes com as condições ótimas verificou-se a necessidade de aumentar a [OH^-] para 1,0 mol/L, pois parte do hidróxido após a secagem não estava disponível no meio, diminuindo a cinética da reação. Para a análise do AU obteve-se que os dois fatores de maior influência para a reação são tempo de aquecimento e [Fe(III)], cujos valores ótimos foram de 0,0448 mol/L e 46,7 s. O tempo de aquecimento utilizado foi de 50 s nos dois experimentos. A figura 1 ilustra as curvas de nível para os dois analitos. A figura 2 ilustra o layout do µPAD antes e após a análise de uma amostra. A curva analítica para a CRN foi repetitiva, apresentando faixa linear de trabalho de 50 a 600 mg/L, com equação de reta A = -0,02229 + 0,0004010C_CRN, R² = 0,998, limite de detecção (LD) 15,7 mg/L e limite de quantificação (LQ) 52,4 mg/L. A curva analítica para o AU também apresentou repetitividade, apresentando faixa linear de trabalho de 50 a 500 mg/L, com equação de reta igual a A = 0,01651 + 0,0003864C_AU, R² = 0,997, LD 16,5 mg/L e LQ 54,9 mg/L. Dentre os interferentes testados para as duas reações apenas o ácido ascórbico apresentou interferência para o AU, o qual foi eliminado por borbulhamento de ar na amostra por 20 minutos. O método proposto para determinação de AU e CRN foi aplicado em amostra de urina sintética e os resultados encontrados foram confrontados com os obtidos pela metodologia comparativa, mostrando que há uma boa correlação entre os resultados das duas metodologias.

Curvas de nível para a CRN (a) e AU (b). n = 3 e canal de cor verde.


Análise de AU e CRN em urina sintética pelo método desenvolvido e comparativo (n = 3). µPAD utilizado para análise de AU(a) e de CRN(b). C = 400mg/L.

Conclusões

O µPAD projetado e as reações estudadas neste trabalho viabilizaram a determinação simultânea dos analitos com detecção por imagem digital. O novo método desenvolvido para determinação de ácido úrico e creatinina apresentou figuras de mérito promissoras para a análise em urina. Dentre os interferentes estudados, somente o ácido ascórbico interfere na determinação do ácido úrico, mas é facilmente eliminado. Os resultados obtidos na análise de urinas sintéticas pela metodologia desenvolvida e a descrita na literatura apresentam boa correlação, o que indica a exatidão do método proposto.

Agradecimentos

Ao Instituto de Química/UNESP, FAPESP/CAPES (Processo nº 2014/17749-7), CNPq e ao Prof. Emanuel Carrilho (IQSC/USP) pelo apoio e suporte na confecção dos µPAD.

Referências

CHAVES, L. D. P. et al. Estudo da sobrevida de pacientes submetidos a hemodiálise e estimativa de gastos no município de Ribeirão Preto – SP. Revista da Escola de Enfermagem da USP, Ribeirão Preto, v. 2, n. 2, p. 193-199, out. 2002.
LAUBE, N.; MOHR, B.; HESSE, A. Laser-probe-based investigation of the evolution of particle size distributions of calcium oxalate particles formed in artificial urines. Journal of Crystal Growth, v. 233, p. 367-374, June 2001.
MARTINEZ, A. W. et. al. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Analyical Chemistry, v. 82, p. 3-10, Jan. 2010.
MOTTA, V. T. Nitrogênio não-protéico. In: ______. Bioquímica Clínica: princípios e interpretações. 4. ed. Porto Alegre: Editora Médica Missau, 2003. Cap. 15, p. 232-246.
XIANG, L. W. et. al. Determination of gouty arthritis' biomarkers in human urine using reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical Analysis, v. 4, n. 2, p. 153-158, Nov. 2013.