ESTUDOS SAR E DOCKING MOLECULAR E NOVOS COMPOSTOS NITROFURANOS CONTRA DOENÇA DE CHAGAS

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Físico-Química

Autores

Santos, M.A.B. (UEPA/CAMPUS IX-ALTAMIRA) ; Alves, S.S.S. (IFPA) ; Oliveira, L.F.S. (LQTC/UFPA) ; Gil, F.S. (LQTC/UFPA) ; Figueiredo, A.F. (IFPA) ; Pinheiro, J.C. (LQTC/UFPA)

Resumo

A utilização dos métodos de reconhecimento de padrões PCA, HCA, KNN, SIMCA e SDA possibilitou a construção do modelo SAR para previsão da bioatividade dos compostos contra Tripanossoma cruzi. Com este modelo SAR, dez (10) novos compostos nitrofuranos foram planejados com o auxílio do Mapa de Potencial Eletrostático e submetidos à previsão. Os estudos docking molecular dos compostos nitrofuranos com a enzima tripanotiona redutase evidenciou que todos os compostos planejados conseguiram penetrar na cavidade do sítio catalítico, pois apresentaram baixos valores de energia livre de ligação do complexo enzima-ligante. Com os nossos resultados, é possível compreender os requisitos estruturais e moleculares para o planejamento de novos ligantes para ser utilizados como agentes antichagásicos.

Palavras chaves

Doença de Chagas; Análise Quimiométrica; Docking Molecular

Introdução

Na atualidade, observa-se um extraordinário incremento do poder computacional e uma notável sofisticação das técnicas de computação em Química. A implementação de algoritmos mais eficientes, possibilitaram a obtenção de um maior número de propriedades e a popularização dos programas tem tornado os cálculos computacionais uma ferramenta essencial no estudo de átomos e moléculas. A aplicação de química computacional nas ciências biológicas e de materiais é cada vez mais crescente em virtude da possibilidade de trabalhar com sistemas complexos antes inacessíveis de se investigar, seja pela dificuldade de isolamento e identificação ou pela dificuldade de síntese. A malária, doença de Chagas, leishmaniose e esquistossomose são responsáveis por incapacitar anualmente uma fração significativa da população de vários países em desenvolvimento, especialmente do continente africano. Estas doenças são chamadas de doenças negligenciadas por representarem um mercado pouco lucrativo para as indústrias farmacêuticas. Apenas 1,3% dos medicamentos disponibilizados entre 1975 e 2004 foi para as doenças negligenciadas, apesar de representarem 12% da carga global de doenças. A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T-cruzi), que atinge 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50 mil mortes ao ano e deixa 100 milhões de pessoas sob o risco de infecção (WHO, 2014). Uma das causas para o elevado índice de mortalidade é a ausência do suporte fundamental à pesquisa e ao desenvolvimento de medicamentos voltado para o tratamento de enfermidades que atingem os mais pobres. Nesse cenário, fica evidente a necessidade do planejamento racional de fármacos baseado em estrutura química com o intuito de obter novas drogas que apresentem boa eficácia e baixos efeitos colaterais. A utilização de técnicas de simulação computacional favoreceu o aumento nas pesquisas científicas relacionadas à doença de Chagas, pois como os projetos GENOMA e PROTEOMA disponibilizam informações sobre a estrutura de proteínas, aumentou-se os estudos da interação fármaco-receptor, com destaque para a Tripanotiona redutase (TryR), uma enzima que tem sido amplamente estudada como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos. Além disso, várias moléculas pequenas vêm sendo exploradas em programas de química medicinal com a aplicação de métodos de planejamento de fármacos baseados na estrutura do receptor (SBDD - structure-based drug design) e na estrutura do ligante (LBDD - ligand-based drug design). Estudos realizados por Santos et al., (2014) demonstram que compostos nitrofuranos reduzem a atividade enzimática da TryR. Os estudos SAR transformam as propriedades moleculares em formas matematicamente quantificadas e computadorizadas. Uma vez conhecida à correlação entre a estrutura e atividade, quaisquer compostos, inclusive as ainda não sintetizadas, podem ser facilmente modelados em um computador para selecionar aqueles que são biologicamente promissores e depois, sintetizados e testados em um laboratório. Dessa forma, o modelo SAR economiza recursos e acelera o desenvolvimento de uma nova molécula para uso como drogas. A enzima tripanotiona [N1.N8-bis(glutanionil)espermidina] é um alvo potencial para o desenvolvimento de fármacos com atividade antiparasitária por ser uma enzima chave no metabolismo redox do T-cruzi, comum a todos os parasitas da ordem kinetoplastida, família Trypanosomatidae, mas ausente no hospedeiro. Os compostos nitrofurânicos interagem com a TryR, enzima que atua no metabolismo antioxidante do tripanossoma cruzi, através da redução do grupo nitro que resulta na perturbação do fluxo fisiológico de elétrons inibindo o processo de produção de energia celular. Neste trabalho, compostos nitrofurânicos derivados da 5-nitrofurano-2-aldoxima com atividade antichagásica serão planejados com o uso de técnicas de modelagem molecular, uma vez que, computadores aumentam consideravelmente as possibilidades de investigação científica na descoberta de novas drogas e, com isso, possibilitam aos químicos coletar, armazenar, manipular, analisar e visualizar dados. Os objetivos são: (1) estudar a relação estrutura- atividadede dos compostos bioativos usando métodos quimiométricos; (2) calcular os descritores moleculares e construir a matriz de dados para estudos quimiométricos com Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise Hierárquica de Agrupamentos, HCA; (3) utilizar os métodos de reconhecimento de padrões KNN, SIMCA e SDA para classificação dos compostos nitrofuranos; (4) Construir os mapas de potencial eletrostático molecular (Mapa MEP) dos compostos nitrofuranos para auxiliar na proposição de novos compostos (conjunto teste); (5) Realização de cálculos docking molecular para os compostos do conjunto treinamento e do conjunto teste; (6) Estudar a energia livre de ligação do complexo enzima-ligante obtido no docking molecular.

Material e métodos

Os mapas de MEP do conjunto treinamento (previamente estudado) auxiliaram na proposição de dez (10) novos compostos nitrofuranos (não sintetizados) para investigação da atividade anti T-cruzi (Figura 1A). Estes foram submetidos a cálculos de estrutura eletrônica em nível HF/6-31G∗ com o intuito de se obter os descritores moleculares e construção da matriz de dados. Os descritores geométricos, estruturais, estéricos, eletrônicos, hidrofóbicos entre outros, utilizados na matriz de dados, foram construídos com os seguintes softwares: Gaussian 98, HyperChem 8.02, Molekel 5.4 e e-Dragon. As cargas atômicas foram obtidas com a palavra POP=CHELPG através do potencial eletrostático. Com essa estratégia é possível obter o melhor potencial molecular quântico de um conjunto de pontos definidos ao redor da molécula e as cargas atômicas apresentam vantagem de em geral serem fisicamente mais satisfatórias do que cargas de Mulliken. Posteriormente, fez-se a análise quimiométrica através dos métodos PCA, HCA, KNN, SIMCA e SDA disponíveis no programa Pirouette. Com a PCA a dimensão da matriz de dados será reduzido e os principais descritores moleculares serão selecionados para obtenção do modelo SAR. O HCA fará a classificação por similaridade. O método KNN classifica objetos com base na comparação de distancias entre eles. As distâncias euclidianas entre todos os pares de amostras são calculados dentro de uma mesma classe. O método SIMCA constrói modelos para classificação dos compostos nitrofuranos em um conjunto de treinamento. Neste método uma caixa tridimensional para cada classe é criada. A análise discriminante é uma técnica clássica utilizada para classificação dos compostos nitrofuranos em grupos. A última etapa da investigação computacional consiste nos estudos de docking molecular com a enzima Tripanotiona redutase (TryR) obtida no Banco de dados de Proteína (PDB) com o código 1BZL. Os átomos de hidrogênio e moléculas de água são retirados da enzima e as interações fármaco-receptor foram calculados empregando o algoritmo genético Lamarckiano implementado no programa Autodock 4.2. Para cada interação ligante/receptor, as conformações foram analisadas e a mais provável de representar o real sistema formado pelo complexo foi escolhida para avaliar a energia livre de ligação do complexo e as distâncias entre os átomos de oxigênio O1 e O2 do grupo nitro e os resíduos de cisteína 53 e 58 a partir da cistina (Cys-SH). Os gráficos moleculares e o tratamento prévio da enzima foram realizados pelo programa UCSF- Chimera. Os arquivos do receptor e ligante foram reunidos em um único arquivo para efetuar os cálculos de docking molecular com o software Autodock Vina. A caixa foi construída utilizando o resíduo cys-53 como centro da caixa (x=+58,966; y=1,834; z=11,131) de tamanho 50×50×50 pontos com espaçamento de 0,375Å. Nos estudos enzima-ligante foram realizados 100 corridas para avaliação da estabilidade do sistema.

Resultado e discussão

Os mapas de potencial eletrostático molecular foram construídos para os compostos nitrofuranos utilizados na construção do modelo SAR (Figura 1B). Propriedades estéricas e eletrônicas são importantes descritores utilizados na investigação da interação fármaco-receptor, e neste sentido, o mapa de potencial eletrostático molecular é uma ferramenta útil na compreensão da atividade biológica dos compostos nitrofuranos. Analisando os mapas de MEP para os nitrofuranos do conjunto teste, percebe-se uma similaridade entre eles e os mapas de MEP do conjunto treinamento. O padrão identificado foi novamente o maior potencial eletrostático negativo no átomo de oxigênio da carbonila e a cadeia terminal destes compostos apresentarem coloração verde, característicos de potencial eletrostático neutro, o que contribui significativamente no aumento da lipofilicidade dos nitrofuranos investigados. Os potenciais eletrostáticos positivos, região em azul, para todos os compostos estudados concentra-se principalmente nos átomos de hidrogênios, diferenciando nas posições e com quem estão ligados. O maior potencial positivo situa-se sobre o átomo de hidrogênio da ligação N-NH-COO- R. O átomo de nitrogênio do grupo nitro (-NO2) também apresenta potencial eletrostático positivo em todos os compostos nitrofuranos estudados, sendo passivo a um ataque nucleofílico, que pode ocasionar a redução deste a grupo amina (-NH2). Os potenciais eletrostáticos negativos, região em vermelho, para todos os compostos estudados concentra-se principalmente nos átomos de oxigênio, na qual o valor mais baixo da carga encontra-se em torno de +0,179 a.u. Os átomos de oxigênio do grupo nitro estão sujeitos a um ataque eletrofílico, devido elevada densidade eletrônica desta região. O composto 33 apresenta em sua estrutura química o substituinte característico de uma antraquinona, com seus átomos de oxigênio apresentando elevados potencial negativos. Pela análise da tabela 1, observamos que, tanto o PCA quanto o HCA classificaram apenas o composto 26 como inativo, ou seja, 90% dos compostos nitrofuranos propostos foram classificados ativos. Isto demonstra que a metodologia utilizada (mapas de MEP) para a proposição de novos compostos antichagásicos é adequada, em virtude do elevado percentual de compostos nitrofuranos classificados como ativos. A análise realizada pelo KNN classificou oito (8) compostos como ativos. Apenas os compostos 31 e 32 foram classificados como inativos. O composto 32 por apresentar relativa diferença estrutural (cadeia terminal heterocíclica) dos demais compostos nitrofuranos, estava previsto que o método KNN o classificaria como inativo. Ao combinarem os três métodos de reconhecimento de padrões, PCA, HCA e KNN, os compostos 24, 25, 27, 28, 29, 30, 33 mantiveram-se classificados como ativos, resultando ainda em 70% de compostos ativos. O método SIMCA classificou os compostos 24, 25, 27, 28, 30 e 33 como ativos. Os compostos 29, 31 e 32 não foram classificados e o composto 26 foi o único classificado como inativo. Ao examinarmos os quatro métodos quimiométricos, temos os compostos 24, 25, 27, 28, 30 e 33, enquadrados como compostos nitrofuranos ativos. Pela analise discriminante por etapas (SDA), os compostos 25, 29 e 30 foram incluídos na classe dos ativos e os demais compostos foram incluídos na classe dos menos ativos. Pela analise realizada com os cinco métodos quimiométricos, os compostos 25 e 30 são potencialmente ativos para futuros testes. De acordo com as quatro variáveis encontradas como importantes na atividade anti T-cruzi, podemos verificar que pertencem a três classes distintas: descritores eletrônicos (GAP e qN1), estéricos (Mor05u) e hidrofóbicos (MlogP). Portanto, podemos concluir estas propriedades possuem papel muito importante quando se investiga a atividade dos compostos nitrofuranos contra doença de Chagas. A formação do complexo entre enzima ligante pode ser vista como a soma das várias contribuições energéticas que, por sua vez, podem ser interações favoráveis ou desfavoráveis, portanto a formação do complexo é favorecida pela diminuição da energia livre Gibbs. A tabela 1, apresenta a energia livre de ligação (ELL) obtida nos cálculos docking molecular. As ELL obtidas com a interação entre compostos nitrofuranos e a enzima TryR apresentam valores negativos, caracterizando a estabilidade do complexo enzima-ligante, entretanto, os compostos nitrofuranos planejados (conjunto teste) apresentam as menores ELL, evidenciando que o modelo SAR, previamente estabelecido, foi satisfatoriamente adequado para proposição de novos candidatos a fármacos anti T-cruzi. A interação mais favorável foi a do composto 33 (-12,14 Kcal/mol), enquanto que, a menos favorável é a do composto 14 (-1,78 Kcal/mol). Tripanotiona redutase (TryR) foi escolhido como alvo molecular para os estudos de docking por ser uma enzima encontrada apenas no organismo do protozoário flagelado Tripanosoma-cruzi (Figura 2). O composto 25 também ancorou-se adequadamente no sitio ativo da enzima, pois o grupo nitro do anel furano encontra-se a 3,43Å da Cys58; favorecendo os efeitos eletrônicos entre o ligante e o receptor. A carbonila interage por meio de ligação hidrogênio com Lys61. A cadeia lateral do anel furano interage de forma hidrofóbica com Leu334 enquanto que a cadeia terminal apresenta interação com Ile200. O composto 30 ancorou-se no sitio ativo de modo que o grupo nitro encontra-se 2,89Å próximo do Cys58 e a carbonila também faz interação com Cys53, caracterizando forte interação ligante-receptor. Ligações hidrogênio é observada entre -NH- do ligante com Asp327, A cadeia terminal faz interação hidrofóbica com Lys61. Pela analise dos resultados obtidos com o planejamento computacional baseado na estrutura do receptor, podemos concluir que a investigação através dos estudos docking molecular da enzima TryR com os compostos nitrofuranos, possibilitou o melhor entendimento do mecanismo de ação destes compostos para inibição enzimática do tripanosoma cruzi. Os cálculos computacionais enzima-ligante forneceram importantes informações sobre os principais resíduos aminoácidos do sitio ativo e, assim, o aprimoramento da estrutura dos compostos lideres para combater a doença de Chagas.

(A) Compostos nitrofuranos planejados (B) Mapa de Potencial Eletrostático Molecular dos compostos "25" e "30"


Resultados da predição com os métodos de reconhecimento de padrões e Docking molecular dos compostos "25" e "30" no sitio catalico da enzima TryR.

Conclusões

Neste trabalho, os métodos quimiométricos PCA e HCA foram empregados como critério na escolha da seleção da metodologia computacional a ser empregada na etapa de modelagem molecular dos compostos nitrofuranos. Os resultados apresentados indicam que o método HF/6-31G é o que mais se aproxima dos dados experimentais. De acordo com os modelos construídos com os métodos PCA, HCA, SDA KNN e SIMCA os compostos nitrofuranos estudados podem ser classificado em duas classes (Grupos para o modelo SDA): positivo para ATIVOS e negativo para INATIVOS, considerando o grau de atividade contra doença de Chagas. O modelo SAR construído e os mapa MEP construídos, auxiliaram na proposição de novos compostos com atividade contra T-cruzi, de modo que, os dez compostos sugeridos apresentaram elevados níveis interação com o receptor biológico. Dentre estes compostos, após análise quimiométrica com métodos de reconhecimento de padrão, 60 % deles foram classificados como ativos. Com a análise dos modos de ligação obtidos no docking molecular, pode-se evidenciar que praticamente todos os compostos nitrofuranos estudados penetraram na cavidade do sitio catalítico da enzima TryR, de tal forma que, o valor da energia livre de ligação do complexo enzima-ligante foi de negativo para todos os compostos estudados. As interações intermoleculares conduz que compostos com cadeia terminal alifática com baixa densidade eletrônica apresenta maior interação hidrofóbica e consegue interagir adequadamente com os aminoácidos Trp22, Ile200, Thr335 entre outros. O grupo nitro apresentou forte interações com o aminoácido Cys58 contribuindo para o desequilíbrio do sistema tripanotiona ditiol/tripanotiona disulfeto. O estudo SAR dos compostos nitrofuranos proporcionaram uma melhor compreensão dos requisitos estruturais e eletrônicos destes com a atividade antiparasitária.

Agradecimentos

Agradecemos ao Laboratório de Química Teórica e Computacional da UFPA pelo suporte computacional.

Referências

SANTOS, Marcos A. B. et al. Modelagem Computacional da Atividade Antichagásica de Compostos Nitrofuranos através de métodos quimiométricos e Mapas de MEP. In: VII Escola de Modelagem Molecular de Sistemas Biológicos, LNCC, 2014. PINHEIRO, J. Ciríaco et al. Antimalarial activity of dihydroartemisinin derivatives against P. falciparum resistant to mefloquine: a quantum chemical and multivariate study. Journal of Molecular Structure. vol. 572, p. 35-44, 2001.