Estudo da toxicidade de compostos guanidilados pela técnica de letalidade de Artemia salina leach.

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Iniciação Científica

Autores

Mendonça, T.L.F. (UEG-CCET) ; Andrade, C.C. (UEG-CCET) ; Mendonça, M.A.G. (UEG-CCET) ; Costa, M.B. (UEG-CCET)

Resumo

O estudo do potencial toxicológico de compostos provenientes de síntese orgânica é considerado um teste preliminar, para a determinação de testes com potenciais biológicos. Este trabalho foi desenvolvido no LASIMCO da UEG/CCET e teve como objetivos principais, a síntese das guanidinas, N-{(E)- {[5-bromo-3-(trifluorometil)piridina-2-il]-amino}[(4-etoxifenil)-amino]- metilideno}-benzamida (1), Etil-{bis[(4-metoxifenil)-amino]-metilideno}- carbamato (2), Etil-{(Z)-(cicloexilamino)-[(4-metoxifenil)-amino]- metilideno}-carbamato (3) e sua toxicidade frente à Artemia salina Leach. As guanidinas 1 e 2 apresentaram baixa toxicidade atingindo CL50 de 295,4007 μg/mL e 264,2239 μg/mL respectivamente, a guanidina 3 atingiu CL50 igual à 205,4066 μg/mL apresentando toxicidade moderada.

Palavras chaves

Guanidina; Bioensaio; Tóxico

Introdução

Os ensaios empregados a partir do teste de letalidade frente à Artemia salina Leach apresentam-se como uma ferramenta viável, devido sua simplicidade, eficiência, rapidez, baixo custo e principalmente por permitir boas correlações de citotoxicidade dentre outras propriedades biológicas (MONTANHER et al., 2003). Os testes em A. salina Leach definem valores da concentração letal média CL50 em μg/mL de compostos sintéticos, sendo que dezenas de substâncias ativas conhecidas apresentam toxicidade ao realizar este teste (MEYER et al., 1982). A atividade é considerada significativa quando a estimação do valor da CL50 é menor que 1000 μg/mL (STEFANELLO et al., 2006). Onde os níveis de CL50 em A. salina são: CL50 < 80 μg/ mL, altamente tóxicos; entre 80 μg/ mL e 250 μg/ mL, moderadamente tóxico; e CL50 > 250 μg/ mL, com baixa toxicidade ou não tóxico (DOLABELLA et al., 2009). Neste trabalho o bioensaio de letalidade A. salina Leach, foi utilizado no monitoramento de compostos guanidilados. Guanidinas são um grupo de compostos nitrogenados presentes em diversos produtos naturais, isolados de microorganismos (WONG et al., 2010). Com caráter altamente básico, direciona para que possam ser facilmente protonados em pH fisiológico e assim, existir na forma iônica, como um reconhecedor eficiente de substratos aniônicos, tais como carboxilatos, fosfatos e nitros (CAI et al.,2013). O amplo espectro de atividades biológicas, apresentadas pelos compostos guanidínicos (anti-helmíntico, anti-histaminíco, anti-diabético, antibacteriano e etc), faz com que este composto seja um interessante alvo sintético para muitos grupos de pesquisa, por favorecer a produção de novos derivados guanidínicos, principalmente a aplicação destes derivados em novas metodologias sintéticas (CUNHA et al., 2001).

Material e métodos

As guanidinas utilizadas foram sintetizadas no LASIMCO, Laboratório de Síntese, Isolamento e Modificação de Compostos Orgânicos (UEG/CCET). A metodologia sintética proposta para as guanidinas foi baseada no método proposto por Cunha e colaboradores, no qual resultou em três diferentes guanidinas caracterizadas por ponto de fusão e espectroscopia IV. A toxicidade dos compostos, testada pelo bioensaio de letalidade frente A. salina, utilizou a metodologia adaptada de Molina & Said (2006). Foi empregado o meio de água marinha sintética, preparado com a dissolução em água destilada de sal marinho (40 g/L) suplementado com extrato de leveduras (6 mg/L) e esterilizado em autoclave. O pH foi ajustado a 8,5 com solução de carbonato de sódio 0,1 mol/L, 80 mg dos náuplios foram incubados por 48 horas em 1 L do meio com iluminação artificial, com temperatura ambiente e oxigenação constante. Após a eclosão, os náuplios foram atraídos por fonte de luz, pipetados e transferidos para uma placa de petri com 5 mL de meio fresco. O bioensaio foi realizado em microplaca de poliestireno estéril de 96 poços na qual foram adicionados diferentes concentrações (500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg/mL) de cada composto. Os náuplios foram distribuídos na placa, padronizando um total de 10±1 de indivíduos em cada poço. Foram incluídos nos ensaios controles positivos, de viabilidade e de letalidade utilizando diluições de dicromato de potássio. O padrão de toxidez utilizado foi o DMSO. Os resultados foram obtidos a partir da contagem do número de componentes vivos e mortos após 24 horas em contato com os compostos em estudo. O cálculo da CL50 foi pelo método gráfico para dose-resposta-Probit, no programa Statistica 10. Todos os ensaios realizados foram feitos em triplicata e de maneira independente.

Resultado e discussão

As guanidinas sintetizadas foram: N-{(E)-{[5-bromo-3- (trifluorometil)piridina-2-il]-amino}[(4-etoxifenil)-amino]-metilideno}- benzamida (1); Etil-{bis[(4-metoxifenil)-amino]-metilideno}-carbamato (2) e a Etil-{(Z)-(cicloexilamino)-[(4-metoxifenil)-amino]-metilideno}-carbamato (3). E tiveram o potencial toxicológico testado em A. salina Leach. As CL50 dos compostos guanidilados testados estão demonstradas na (Tabela 1). Comparando os valores de CL50 (Tabela 1), pode ser observado que as guanidinas (1) e (2) apresentaram baixa toxicidade, a guanidina (3) pode ser considerada moderadamente tóxica. Os compostos apresentaram ser parcialmente solúvel no meio utilizado para os ensaios, não permitindo a determinação dos valores de CL50. A utilização de 2 % DMSO, facilitou a solubilização dos compostos guanidilados. O bioensaio do controle com dicromato de potássio (K2Cr2O7) indicou que os náuplios não foram afetados pela composição da mistura com o solvente. Assim como o teste do branco, onde foi utilizada apenas a solução salina, apresentou mortalidade abaixo de 10%, confirmando que a solução utilizada não influenciou no resultado dos testes. Existe correlação entre a toxicidade e a citotoxicidade, onde a CL50 obtida frente à Artemia salina é 10 vezes maior do que para testes frente à linhagens celulares e tumores, assim as guanidinas podem ser testadas em ensaios de citotoxicidade.

Conclusões

Os resultados indicam que as guanidinas sintetizadas, apresentaram toxicidade ao bioensaio frente à Artemia salina Leach. Os compostos exibiram pontencialidades para outras atividades biológicas, a guanidina Etil-{(Z)- (cicloexilamino)-[(4-metoxifenil)-amino]-metilideno}-carbamato apresentou maior toxicidade que as guanidinas N-{(E)-{[5-bromo-3- (trifluorometil)piridina-2-il]-amino}[(4-etoxifenil)-amino]-metilideno}- benzamida e a Etil-{bis[(4-metoxifenil)-amino]-metilideno}-carbamato, com um maior potencial para atividades antimicrobiana e antitumoral, fato a ser verificado em estudos futuros.

Agradecimentos

FAPEG (Fundação de amparo à pesquisa do estado de Goiás) Ao grupo de pesquisa do LASIMCO, Laboratório de Síntese, Isolamento e Modificação de Compostos Orgânicos (UEG

Referências

CAI, Z. S.; SUN, Y. M.; ZHU, X. M.; ZHAO, L. L.; YUE, G. Y.; Preparation, Characterization, and Antibacterial Activities of Para-Biguanidinyl Benzoyl Chitosan Hydrochloride. Polymers Bulletin, v. 70, p.1085-1096, 2013.

CUNHA, S. D.; COSTA, M. B.; NAPOLITANO, H. B.; LARIUCCI, C.; VENCATO, I.; Study of N-benzoyl-activation in the HgCl2-promoted guanylation reaction of thioureas. Synthesis and structural analysis of N-Benzoyl-guanidines. Tetrahedron, v. 57, p. 1671-1675, 2001.

DOLABELLA, M. F.; COSTA, E. S. S.; PÓVOA, M. M.; OLIVEIRA, D. J.; MÜLLER, A. H.; Estudos farmacognósticos, fitoquímicos, atividade antiplasmódica e toxicidade em Artemia salina de extrato etanólico de folhas de Montrichardia linifera (Arruda) Schott, Araceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, p. 834-838, 2009.

MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R., PUTNAM, J. E.; JACOBSEN, L. B.; NICHOLOS, D. E.; MCLAUGHLIN, J.L.; Brine Shrimp: A convenient general bioassay for active plants constituents. Planta Medica, v. 45, p. 31-34. 1982.

MOLINA, S.G.M.; SAID, F.S. A modified microplate cytotoxicity assay with brine shrimp larvae (Artemia salina). Pharmacology online. n. 3, p. 633-638, 2006.


MONTANHER, A B. P.; PIZZOLATTI, M. G.; BRIGHENTE, I. M. C.; Monitoramento dos extratos brutos de espécies de Polygala (Polygalaceae) utilizando Artemia Salina. Revista Brasileira de farmacognosia, v. 13, p. 66-68, 2003.

STEFANELLO, M. E. A.; SALVADOR, M. J.; ITO, I. Y.; MACARI, P. A. T.; Avaliação da atividade antimicrobiana e citotóxica de extratos de Gochnatia polymorpha ssp fl occosa. Brazilian Journal of Pharmacology, v. 16, p. 525-530, 2006.

WONG, F. F.; CHEN, C. Y.; LIN, H. C.; HUANG, Y. Y.; CHEN, K. L.; HUANG, J. J.; YEH, M. Y.; ‘One-flask’ transformation of isocyanates and isothiocyanates to guanidines hydrochloride by using sodium bis(trimethylsilyl)amide. Tetrahedron, v. 66, p. 1892-1897, 2010.