Determinação da Viabilidade Celular em Biofilme Formado por Bactérias da Família [i]Rhizobiaceae[/i]

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Augusta Marinho Malaquias, N. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS) ; de Sousa Oliveira, M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS) ; Moreira Lima, L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS) ; Cristina Garcia Martin Didonet, C. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS) ; Lázaro Faleiro Naves, P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS)

Resumo

Rizóbios são bactérias simbióticas de grande importância agronômica, devido a sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico. Este estudo determinou a viabilidade celular de cinco bactérias da família Rhizobiaceae em biofilmes formados em microplacas de poliestireno, avaliando o impacto de diferentes meios de cultura na produção do mesmo.Os biofilmes foram corados com resazurina para cálculo da porcentagem de metabolização do corante. A estirpe BR522 apresentou o maior índice de viabilidade nos biofilme nos meios, com os índices de 76,8% e 67,7%. A estirpe BR322 foi a que apresentou menor quantidade de células viáveis independente do meio. Conclui-se que a viabilidade das bactérias associadas ao biofilme é dependente do tipo de micro-organismo e do meio de cultura empregado.

Palavras chaves

Rizóbios; Viabilidade Celular; Resazurina

Introdução

Rizóbios são bactérias do solo fixadoras de nitrogênio capazes de entrar em uma simbiose com leguminosas suprindo total ou parcialmente a demanda de nitrogênio da planta hospedeira (RASHID, et al, 2014). No ambiente natural, as bactérias predominantemente coexistem em comunidades multicelulares de matriz fechada denominadas de biofilmes (PLYUTA et al, 2013). O biofilme é um conjunto formado por um ou mais micro-organismos envolvidos numa matriz polimérica extracelular, aderido a uma superfície biótica ou abiótica. Os biofilmes apresentam uma composição heterogênea, configurando uma estrutura complexa de micro colônias e canais que permitem fluxo de fluidos e nutrientes (FREITAS et al, 2010; WIEDMANN et al, 2002). Um dos ensaios de viabilidade celular é baseado na redução da resazurina por células metabolicamente ativas. Este é um composto azul que pode ser reduzido a resorufina de cor rosa que é florescente (PEETERS et al, 2008). O corante resazurina, solúvel em tampão fosfato, é extremamente estável, não tóxico, não lesivo e não promove a desagregação celular, no caso das células aderidas. (BORRA et al., 2009). O presente estudo teve por objetivo quantificar a viabilidade celular de rizóbios associadas a biofilmes através da técnica de metabolização da resazurina. O trabalho busca avaliar entre três meios de cultura diferentes qual apresenta maior capacidade de formar biofilme com células metabolicamente ativas, visando entender o comportamento das estirpes em diferentes condições nutricionais e auxiliar a produção de veículos de inoculação.

Material e métodos

Para a realização deste trabalho foram utilizadas cinco estirpes controle obtidas junto a Embrapa Arroz e Feijão de Santo Antônio de Goiás. BR322 (Rhizobium tropici), BR520 (Rhizobium tropici), BR10055 (Rhizobium galegae), CFN42 (Rhizobium etli) e BR522 (Mesorhizobium mediterraneum). Para a avaliação da formação de biofilme foram escolhidos três meios de cultura: YM (HUNGRIA, ARAUJO, 1994), RDM (CASTELLANE, 2007) e Batata (DOBEREINER, ANDRADE, BALDANI, 1999). Após o crescimento e confirmação da pureza, colônias típicas foram dissolvidas em solução fisiológica estéril (SFE) e os inóculos ajustados para 1,5x10⁵ ufc.mL^-1 nos meios testados. As placas foram incubadas por 24 horas a 30 °C. Após o período de incubação o meio crescido foi removido e cada poço foi lavado uma vez com 200 μL de SFE. A determinação da viabilidade celular (VBC) foi feita através do cálculo da porcentagem de metabolização do corante vital resazurina, com a adição de 100 μL de solução de resazurina 0,001% em cada poço. Em seguida, as placas foram incubadas a 37 °C por quatro horas. Após a incubação, procedeu-se a leitura das densidades ópticas (DO) dos poços a 570 e 600 nm. A determinação da porcentagem de metabolização da resazurina foi calculada pela seguinte fórmula: VBC (%) ={[(117216 x DO570) - (80586 x DO600)] / [(155677 x DOBranco600) - (14652 x DOBranco570)]} x 100. Os resultados foram agrupados em médias e desvio padrão a partir de experimentos realizados em triplicatas independentes.

Resultado e discussão

Todas as cepas apresentaram células viáveis aderidas ao biofilme nos meios testados. No meio batata 80% das cepas analisadas apresentaram capacidade de metabolização da resazurina acima de 60%. No meio YM essa habilidade ficou restrita a 60% das cepas analisadas. No meio RDM a capacidade de metabolizar 60% de resazurina ficou limitada a apenas 20% das cepas analisadas Figura 1. Com o auxílio visual do gráfico Figura 1, nota-se a influência da composição dos meios de cultura na formação do biofilme. Foi observado que a disponibilidade de nutrientes é determinante para uma maior quantidade de células vivas no biofilme. Os meios YM e Batata são os que apresentaram maior quantidade de células metabolicamente ativas, indicando que meios complexos suprem melhor as necessidades fisiológicas das bactérias. Apenas a cepa BR322 não apresentou diferença de VBC nos três meios testados, com metabolização de resazurina variando entre 29,6 a 31,9% Tabela 1. A cepa BR522 apresentou em todos os meios a maior capacidade de metabolização da resazurina, com resultados entre 76,8 a 67,7%. A formação de biofilme é induzida em condições limitadas de nutrientes (RINAUDI et al, 2010). Sendo assim, a disponibilidade de nutrientes desempenha um papel importante na transição a partir de um modo de vida planctônico para um modo séssil. Contudo isso não é observado para bactérias da família Rizobiaceae. A superfície da raiz é um ambiente relativamente rico em nutrientes, e que mesmo assim permite a formação de biofilmes de rizóbio. Uma possibilidade é que um via de regulação ainda desconhecida promova a formação de biofilme e anulando o efeito inibitório do aporte de nutrientes a partir da raiz (RINAUDI et al, 2010).

Valores de viabilidade celular e biomassa total obtidos para as cepas em estudo nos três diferentes meios de cultura.


Disposição gráfica dos resultados obtidos para viabilidade celular nos diferentes meios de cultura analisados.

Conclusões

A partir dos resultados obtidos verificou-se que todas as cepas apresentaram capacidade de formar biofilme e células metabolicamente ativas aderidas ao mesmo. Constatou-se a influência da composição dos meios de cultura na formação do biofilme. Foi observado que meios complexos tem a maior capacidade de promover a formação de biofilme em bactérias da família Rhizobiaceae, sendo melhor alternativa para produção de veículos de nodulação para a agricultura. A viabilidade celular das bactérias associadas ao biofilme é dependente do tipo de micro-organismo e do meio de cultura utilizado.

Agradecimentos

PIBITI/CNPq, PBIT/UEG, CAPES, CNPq/MCT INCT em Fixação Biológica de Nitrogênio e Programa de Bolsa de Incentivo ao Pesquisador (PROBIP).

Referências

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DOBEREINER, J.; ANDRADE, V. O.; BALDANI, V. L. D. [i]Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da Embrapa Agrobiologia[/i]. Rio de Janeiro, 1999. Disponível em: <http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPAB-2010/27335/1/doc110.pdf> Acesso em: 13 jun. 2014.

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