DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES DE MICHAELIS-MENTEN DE XILANASE PRODUZIDAS POR PENICILLIUM ROQUEFORTI EM RESÍDUO DE JACA ATRAVÉS DA FERMENTAÇÃO ESTADO SÓLIDO.

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Marques, G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Montalvão, T.G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Pereira, T. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Brito, A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Ferraz, J.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Franco, M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ)

Resumo

As Xilanases são enzimas que se destacam devido sua ampla área de aplicação industrial, as mesmas são obtidas por diversos microrganismos dentre eles os fungos filamentosos são os principais produtores. A fermentação em estado sólido é uma possibilidade interessante na obtenção de enzimas industriais, por utilizar substratos alternativos como resíduos da agroindústria. Este trabalho teve como objetivo a caracterização cinética da xilanase produzida por Penicillium roqueforti em resíduo de jaca, por fermentação em estado sólido. Foi realizado o estudo cinético através da determinação da constante de Michaelis-menten (Km) e a determinação da velocidade máxima (Vmax). A xilanase produzida mostrou boa afinidade com o substrato, obtendo os valores de Km 2,43 mg/ml e de Vmax 4,49 U/mg.

Palavras chaves

biotecnologia; cinética; enzimas

Introdução

Os setores agroindustriais e de alimentos estão entre os maiores produtores de resíduos. Certamente estes podem apresentar elevados problemas de disposição final e, além de se caracterizarem como potenciais poluentes, causando perdas de biomassa e de nutrientes de alto valor. Em contra partida na atualidade estes vem sendo reaproveitados uma vez que essas matérias apresentam recursos possíveis e utilizáveis para a síntese de produtos úteis. A produção de enzimas de interesse industrial permite o reaproveitamento destes resíduos agroindustriais como fonte de matéria prima nos processos biotecnológicos. Após a descoberta de que certos microrganismos produzem enzimas, foram desenvolvidos processos técnicos para a produção de enzimas microbianas em escala comercial. Dentre esses microrganismos, destacam-se os fungos filamentosos (HOLKER e LENZ, 2005). A fermentação no estado sólido pode ser definida como o processo que se refere à cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou material inerte), onde o conteúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro, não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida (DEL BIANCHI et al., 2001). A xilanase é uma enzima que hidrolisa a xilana presente na hemicelulose (ALEXANDRINO et al. 2007), e essa característica relevante vem sendo explorada pelas indústrias de combustível, alimentos, têxtil , entre outros. Esse trabalho teve como objetivo extrair e caracterizar cineticamente a xilanase produzida por Penicillium Roqueforti através da determinação da constante de Michaelis-Menten (Km) e a determinação da velocidade máxima (Vmax).

Material e métodos

O resíduo de Jaca foi inoculado com o Penicillium Roqueforti a uma concentração de 10^7 esporos/g, para 10 g de resíduo. O processo fermentativo foi conduzido com a variação da temperatura (27°C, 30°C e 33°C), tempo (44h, 72h e 100h) e da atividade de água (0,958, 0,962, e 0,966) seguindo um planejamento fatorial 2^3, com triplicata no ponto central. Ao término do tempo de fermentação, a cada ensaio foi adicionado 50 mL de tampão citrato 50 mM e pH 4,8, essa suspensão permaneceu sob agitação orbitalar (150 rpm), a 30ºC, por 20 minutos. A remoção dos sólidos suspensos foi efetuada por prensagem mecânica e o líquido homogêneo centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos esse sobrenadante utilizado foi denominado extrato enzimático bruto. A atividade da enzima xilanase foi determinada segundo MILLER (1959) através da liberação de açúcares redutores pela hidrólise da xilana. Para a determinação da contante de Michaelis-Mentem (Km) e a velocidade máxima (Vmax) foi utilizada a metodologia de determinação da atividade enzimática descrita no item anterior, variando a concentração do substrato de 2 a 10 mg/mL. Todos os ensaios foram realizados em triplicata (PINHEIRO, 2003).

Resultado e discussão

Observando o ensaio enzimático em estudo vê-se que quanto maior a concentração do substrato, maior a atividade enzimática (Tabela 1), corroborando com estudos desenvolvidos por autores como Siqueira (2009) e Dini (2010). Para construir a curva de Michaelis-Menten e a partir da construção da curva utilizou-se os dados da tabela 1 e então foi obtida a equação da reta que será útil para a determinação do Km e Vmax (figura 1). Através da equação de Michaelis-Menten é possível a transformação em gráfico dos duplos recíprocos ou Lineweaver-Burke, o gráfico de 1/V0 versus 1/[S] é representado por uma linha reta (NELSON e COX, 2006). O Km de um substrato é a concentração do substrato na qual a velocidade inicial de reação equivale à metade da velocidade máxima (LEHNINGER et al 1995). Segundo SEGEL (1979), quanto maior valor de Km menor a afinidade do substrato pela enzima. O Km é definido como a concentração de substrato necessária para que a velocidade da reação enzimática seja a metade da máxima (Vmáx). Em alguns casos, mudanças nas condições de reação, como pH ou temperatura, podem ter influencia no valor de Km (COPELAND, 2000). Os valores de Km e Vmáx da xilanase produzida por Penicillium Roqueforti são respectivamente 2,43 mg/mL e 4,59 U/mg, demonstrando assim grande afinidade da xilanase pelo substrato. SANDRIM et. al (2005 ) realizaram a caracterização da enzima xilanase de outros fungos A.caepistousus apresentou Km de ( 2,5 e 3,9 mg/mL). SILVA et.al (1999) encontrou um Km de 5,72 mg/mL para xilanase por A. furmigatus, os valores encontrados por eles são maiores ao encontrado nesse estudo, demonstrando vantagens sobre estes.

Resultados da atividade enzimática de xilanase submetida a variação de concentração de xilana.


Representação gráfica dos coeficientes de Michaelis-Menten.

Conclusões

A xilanase produzida por Penicillium Roqueforti, através da fermentação em estado sólido, demonstrou ser superior a outras xilanases produzidas por outros fungos, tendo uma maior afinidade da enzima ao substrato.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio da CNPq e da Fapesb.

Referências

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