PLANEJAMENTO COMPOSTO CENTRAL APLICADO A OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CELULASES (ATIVIDADE FPASE) POR Penicillium roqueforti EM FARELO DE MANDIOCA ATRAVÉS DA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Pereira Silva, T. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Lima Marques, G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Pereira Montalvão, T.G. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; de Brito, A.R. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; dos Santos Reis, N. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; de Almeida Antunes Ferraz, J.L. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ) ; Franco, M. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ)

Resumo

A biotecnologia aplicada à indústria em geral vem se destacando na atualidade pela possibilidade de produção de biomoléculas através do aproveitamento de rejeitos da agroindústria. Para a determinação das melhores condições para obtenção da celulase (Fpase), foi realizado planejamento composto central. As variáveis estudadas nos seguintes níveis foram: Atividade de água (aw) (0,958; 0,959; 0,966; 0,964; 0,971) e Temperatura (25ºC,26,5ºC, 30ºC, 33,5ºC; 35ºC). Os experimentos foram conduzidos por fermentação em estado sólido em estufa bacteriológica por 72 horas de fermentação. Os resultados apresentam uma região ótima em 72 h, 0,966 aw, 33,5ºC e 1,393 U/g, foi a maior atividade encontrada. Diante disso o resíduo de mandioca e o Penicillium roqueforti, podem ser utilizados para a produçã

Palavras chaves

Penicillium roqueforti; Fpase; Otimização

Introdução

A agricultura brasileira tem se consolidado como o grande vetor de desenvolvimento do país. Essa grande produção em consequência gera um quantitativo de resíduos que por sua vez são responsáveis por uma parcela da poluição e degradação do meio ambiente. Nos últimos anos, tem crescido o interesse pela utilização de resíduos agrícolas. Nesse sentido, as pesquisas com bioprocessos crescem exponencialmente e o foco da maioria delas é produzir compostos com alto valor agregado a partir dos subprodutos agroindustriais (COUTO; SANROMAN, 2006;SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Basicamente, esses subprodutos são constituídos de compostos lignocelulósicos, os quais são os recursos renováveis mais abundantes na natureza, sendo esses constituídos majoritariamente de celulose, hemicelulose e lignina (CASTRO; PEREIRA, 2010; GALEMBECK et al., 2009). Em relação à mandioca, é gerado muito resíduo, que depois de seco tem, em média, a seguinte composição: Amido 63,6 %, Glicose 0,24%, Proteína 2,31%; Fósforo 0,03%; Cálcio 0,09%; Potássio 0,28%; Extrato Etéreo 0,65%, Fibra 8,33% (EMBRAPA 2005). Certamente esse resíduo tem um potencial significativo para a utilização como matriz de fermentação e obtenção de biomoléculas inclusive enzimas celulolíticas. A fermentação no estado sólido (FES) é um processo no qual se utiliza os rejeitos da agroindústria na obtenção de produtos com alto valor agregado. A cultura em estado sólido é definida como sendo o tipo de cultivo no qual um micro-organismo cresce numa mistura de material sólido e água (GERVAIS- 2003). A matriz sólida pode ser qualquer fonte de nutrientes e carbono ou pode ser um suporte inerte impregnado com nutrientes adequados que permite o desenvolvimento dos micro-organismos (THOMAS, et al., 2013; ZHU et al., 2012). Os fungos filamentosos estão entre os organismos mais empregados nos processos biotecnológicos, sendo os mais adaptáveis ao processo de fermentação em estado sólido, ambiente que se assemelha ao seu habitat natural, o que torna mais fácil de conservar e controlar o seu ciclo morfológico, facilitando o seu crescimento no substrato sólido e, portanto obtendo maior rendimento do produto desejado. (HOLKER e LENZ, 2005). Celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. Estas enzimas são biocatalisadores altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua conversão em etanol. Além disso, essa enzima desempenha um papel importante principalmente aplicada à indústria de papel e celulose, têxtil, alimentos e bebidas, indústria de detergentes, biocombustíveis e ração animal. A otimização da produção enzimática é realizada pelo delineamento Composto Central e com o uso da metodologia de superfície de resposta, onde objetiva- se as melhores condições de temperatura e atividade de água, em 72 horas de fermentação do resíduo de mandioca.

Material e métodos

O micro-organismo utilizado foi o fungo filamentoso Penicillium roqueforti, proveniente da coleção de micro-organismos do INCQS/Fiocruz, no. 40075, lote 079840075. A cultura foi esporulada em BDA (Batata, dextrose, ágar) e suspensa em solução de Tween 80 e contada em câmara de Neubauer, utilizando uma concentração de 10 milhões de esporos/g. O farelo de mandioca utilizado foi obtido de uma agroindústria de beneficiamento de alimentos localizada na região sudoeste da Bahia, esse farelo foi submetido a um processo de separação granulométrica, a partir da trituração (20 mesh) em moinho de facas tipo Willey e armazenado a temperatura ambiente. As fermentações foram conduzidas em erlenmeyer de 150 mL contendo 10g do substrato, em seguida foram adicionados diferentes volumes de água estéril até a seguinte atividade de água (0,958; 0,959; 0,966; 0,964; 0,971) sendo cada um inoculado com 10 milhões de esporos/g de substrato. As incubações ocorreram em diferentes temperaturas (25ºC, 26,5ºC, 30ºC, 33,5ºC; 35ºC), por 72 horas. Finalizado o respectivo tempo de fermentação a cada ensaio foi adicionado 50 mL de tampão citrato 50 mM e pH 4,8 essa suspensão permaneceu sob agitação orbital a 30ºC por 20 minutos a 150 rpm. A remoção dos sólidos suspensos foi efetuada por prensagem mecânica e o líquido homogêneo centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos esse sobrenadante utilizado foi denominado extrato enzimático bruto. A atividade enzimática da celulase (Fpase) utilizou-se o procedimento recomendado por GHOSE (1987), tendo-se empregado como substrato o papel de filtro Whatman número 1, cortado em tiras de 1x6 cm e com, aproximadamente, 50 mg. A dosagens do açúcares redutores liberados na degradação do papel Whatman foram determinados pelo método de DNS (acido-3,5-dinitrosalicilico) conforme MILLER et al. (1959), utilizando-se um padrão de glicose e leitura óptica realizada em 540 nm. Nos tubos reacionais foram adicionados 1,0 ml de solução tampão citrato de sódio pH 4,8 a 50 mM e 0,5 ml do extrato enzimático e uma tira de papel filtro. No branco da análise foram adicionados 1,5 ml de solução tampão e uma tira de papel filtro. As amostras foram incubadas em estufa de secagem a 50°C por 1 hora. A reação foi interrompida com a adição de 3 ml de DNS e todos os tubos foram submetidos à água fervente ( banho maria) por 5 minutos e por fim foram adicionados 20 ml de água destilada para posterior leitura em espectrofotômetro a 540 nm. Uma unidade de atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de produto por minuto (GHOSE, 1987).

Resultado e discussão

Para avaliar a influência conjunta das variáveis temperatura e atividade de água foi feito um Planejamento Composto Central. A Tabela 1 apresenta os resultados médios das atividades da enzima celulase após 72 horas de fermentação. Observando os valores da tabela vê-se que os melhores valores de atividade Fpase foi 1,393 U/g no experimento 4 , em seguida os experimentos do ponto central, demonstrando que existe uma região de ótimo bem estabelecida. Enzimas normalmente têm um mecanismo de controle de expressão que pode ser estimulado ou inibido por produtos do meio. Os produtos finais de uma dada via metabólica são frequentemente inibidores de enzimas que catalisam os primeiros passos da via. Este mecanismo é conhecido como a realimentação negativa (SANTANA et al., 2012). BIAZUS et al. (2006), trabalhando com malte de milho, observaram que na produção de enzimas o início é lento, em seguida, acelera até atingir o seu valor máximo. Para ilustrar os efeitos das variáveis na atividade celulásica são apresentadas a superfície de resposta na Figura 1. Esta figura mostra a região de otimização das variáveis na forma real, em relação à resposta atividade celulásica. Os resultados apresentam uma região ótima em 72 h, 0,966 aw, 33,5ºC. BASSO et al., 2010, apresenta em seu trabalho uma produção enzimática (celulase total) por A. niger na fermentação em estado sólido de farelo de trigo durante o período de 96 horas de cultivo, a produção máxima de celulase total 0,4 U/g. Em cultivos com o fungo Penicillium decumbens, foram observados valor de atividade celulásica em torno de 0,4 U por grama de substrato e produtividade de 0,08 U por dia, após cinco dias de fermentação em estado sólido, em farelo de trigo (SUN et al., 2008, BASSO, 2010). Diante do exposto vê-se que o experimento realizado nas condições estudadas obtiveram resultados satisfatórios em relação aos da literatura.

Tabela 1 - Matriz do PCC para as atividades da enzima celulase (FPASE)


Superfície de resposta otimização Fpase

Conclusões

Dentro da faixa estudada para as variáveis: atividade de água e temperatura, foi possível obter regiões de otimização para a atividade da enzima celulase (Fpase). Os resultados mostraram que ocorreu maior produção de celulase (Fpase) de 1,393 U/g em atividade de água, 0,966 aw e temperatura 33,5ºC. Diante disso verificou-se que o resíduo de mandioca pode ser utilizado para a produção da enzima celulase, e que o fungo penicillium roqueforti pode ser utilizado como agente de fermentação neste processo.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq e à FAPESB pelo apoio financeiro.

Referências

BASSO, T.P. et al. Atividade celulolítica de fungos isolados de bagaço de cana‑de‑açúcar e madeira em decomposição. Pesquisa agropecuária brasileira, Brasília, v.45, n.11, p.1282-1289, nov. 2010.
BIAZUS, J. P. M. et al. Study of amylases recovery from maize malt by ion-exchange expanded bed chromatography. Process Biochemistry, v. 41, n. 8, p. 1786-1791, 2006.
CASTRO, A. M.; PEREIRA, N. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, São Paulo, v. 33, n. 1, p. 181-188, 2010.
COUTO, S. R.; SANROMÁN, M. A. Application of solid-state fermentation to food industry – A Review. Journal of Food Engineering, Califórnia, v. 76, n. 3, p. 291-302, 2006.
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Subprodutos da mandioca - composição dos resíduos sólidos ,2005.
GERVAIS, P.; MOLIN, P. The role of water in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 13, n. 2/3, p. 85-101, 2003.
GHOSE T. K. Measurement of cellulase activities. Pure & Applied Chemistry, v.59,p.257-268, 1987.
HOLKER, U.; LENZ, J. Solid-state fermentation – are there any biotechnological advantages? Current Opinion in Microbiology, v.8, p.301–306, 2005.
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v. 31, p. 426-428, 1959.
SANTANA, R.M.; GONÇALVES, Z.S.; BONOMO, R.C.F.; FRANCO, M. Produção de amiloglucosidase utilizando como substrato a palma forrageira. Revista Caatinga, v.25, n.1, p.188-193, 2012.
SUN, Y.; CHENG, J. Hidrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, v.83, p.1-11, 2002.
ZHU, Z.; ZHANG, G.; LUO, Y.; RAN, W.; SHEN, Q. Production of lipopeptides by Bacillus amyloliquefaciens XZ-173 in solid state fermentation using soybean flour and rice straw as the substrate. Bioresource Technology, v.112, p.254–260, 2012.