OTIMIZAÇÃO DA METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO DE COLESTEROL E ÓXIDO DE COLESTEROL EM LEITE DE BÚFALA EM PÓ OBTIDO POR SPRAY-DRYING

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Alimentos

Autores

Alves, M.F. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Borges, M.V. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Brito, M.J.P. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Filho, D.F. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Santana, D.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Ferrão, S.P.B. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Lima, M.D. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA) ; Fernandes, S.A.A. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA)

Resumo

Objetivou-se com este trabalho otimizar metodologia de extração de colesterol e óxido de colesterol (25-hidroxicolesterol) em leite de búfala em pó. O leite foi desidratado por spray-drying. A otimização da metodologia foi realizada por meio de planejamento fatorial fracionado, com pontos inferiores e superiores. As variáveis foram: os volumes da solução de KOH, de álcool, água e hexano adicionada à amostra e o tempo de repouso. Foi utilizada CLAE-DAD. As variáveis não influenciaram (p>0,05) a extração dos compostos, sendo a melhor condição experimental a adição de 3 mL de solução aquosa de KOH, 8 mL de álcool etílico, tempo de reação de 24 h, adicionado 6 mL de água e 8 mL de hexano. Esta condição proporcionou melhores resultados na extração do colesterol e do óxido 25- hidroxicolesterol.

Palavras chaves

derivados lácteos; planejamento fatorial; secagem

Introdução

A introdução do rebanho bubalino no Brasil teve seu início em 1985, particularmente na Ilha de Marajó, no Estado do Pará, onde os primeiros animais foram introduzidos (DIAS, p.59, 2009). Os búfalos são animais poliéstricos estacionais, o que influencia a produção de leite para a indústria, observando- se na entressafra redução de aproximadamente de 60% na produção de leite, o que determina diminuição na oferta de derivados lácteos. Uma das possíveis alternativas para a estabilização da oferta do produto é a sua secagem. Entre os métodos, a secagem por atomização (spray-drying) é o mais utilizado, por gerar produto de boa qualidade com gasto de energia relativamente baixo quando comparado com outros métodos de secagem. No processo de secagem por spray-drying utiliza-se temperaturas acima de 100ºC, o que pode alterar o teor de colesterol assim como, produzir óxidos de colesterol (AL-ROWAILY, p.40, 2008). O colesterol é um composto lipídico insaturado, instável e suscetível à oxidação, sendo o processo oxidativo influenciado por diversos fatores (MORALES- AIZPÚRUA & TENUTA-FILHO, p.431, 2002). Os produtos de sua oxidação são comumente conhecidos como óxidos de colesterol (OsC). Em humanos, estes podem ser formados tanto de forma endógena, basicamente no fígado e nos tecidos geradores de hormônios esteróides (córtex supra-renal, gônadas), quanto ingeridos na dieta (SALDANHA et al, p.4108, 2006). As principais fontes de OsC na dieta humana são alimentos processados de origem animal, como ovos em pó ou produtos que contenham em sua formulação este ingrediente, leite em pó, carne e peixe desidratados e gorduras animais aquecidas (SALDANHA et al, p.4109, 2006; GUARDIOLA et al, p.200, 1996), no entanto, os produtos lácteos são caracterizados por baixo conteúdo de OsC, o menor dentre todos os produtos de origem animal (ORCZEWSKA- DUDEK et al, p.30, 2012). Os métodos cromatográficos, apesar de eficazes, são bastante onerosos. A cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) tem sido empregada em detrimento à cromatografia a gás (CG) na determinação do colesterol em alimentos, devido ao fato de utilizar temperaturas relativamente baixas (30ºC – 40ºC), significativamente comparadas às faixas de temperaturas em que o cromatógrafo a gás trabalha (230ºC - 250ºC). A menor temperatura utilizada na CLAE tem efeito reduzido na oxidação do colesterol (SALDANHA et al, p.111, 2004). O planejamento fatorial, é necessário para indicar quais os fatores que influenciam, seja na produção ou na análise de qualidade, ou, no caso, na determinação de algum composto por extração, quando são conhecidos inúmeros fatores envolvidos no processo que podem, ou não, influenciar os resultados. Com isso, é possível a obtenção de resultados que expressem quais as variáveis influenciam mais, criando-se assim, uma linha com condições ótimas para o determinado processo. De acordo com Galdámez (p.133, 2002), ao realizar experimentos industriais, é comum se verificar a necessidade de se estudar o efeito de um ou mais fatores de controle ao mesmo tempo. A aplicação das técnicas de planejamentos de experimentos fatoriais fracionados 2^k-p, mostra-se como uma das soluções para esse tipo de problema. Ressalta-se que, com essas técnicas, é possível analisar os efeitos sobre uma resposta de interesse, de k fatores com dois níveis cada um, em 2^k-p combinações de testes, realizando-se apenas uma parte (metade do experimento quando p é igual a um, ou um quarto do experimento quando p é igual a dois), sem comprometer significativamente a precisão das conclusões decorrentes da análise de resultados. Simultaneamente, os custos e o tempo de duração dos ensaios são significativamente reduzidos. Neste contexto, objetivou-se com a condução deste trabalho otimizar a metodologia de extração de colesterol e seus óxidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em leite em pó de búfalas.

Material e métodos

O leite de búfala utilizado para a elaboração do leite em pó foi oriundo de búfalas da raça Murrah, ordenhadas uma vez ao dia mecanicamente. A produção do leite em pó foi realizada no Centro de Desenvolvimento e Difusão de Tecnologias (CEDETEC) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB). O processo de secagem por atomização do leite de búfala foi em mini spray drying modelo MSD 3.0, marca LABMAQ do Brasil LTDA, com temperatura do ar na entrada e saída do secador de 140ºC e 75ºC, respectivamente. Após obtenção do produto, as amostras foram embaladas a vácuo e armazenadas em temperatura ambiente até o momento das análises. Para extração do colesterol e seu óxido foi utilizada a metodologia descrita por Saldanha et al. (p. 110, 2004), com modificações no tipo e tempo da saponificação baseadas em Saldanha et al. (p.4108, 2006). Foram pesados 0,5g de amostra, utilizada a massa descrita na metodologia seguida, e adicionado 4 mL de solução aquosa de hidróxido de potássio (KOH) a 50% (p/v) e 6 mL de álcool etílico (PA), após agitação (vórtex) por 1 min, a mistura permaneceu em repouso por 22 horas, no escuro e à temperatura ambiente, para que se completasse a reação de saponificação. Após este intervalo, adicionou-se 5 mL de água destilada e 10 mL de hexano (PA), sendo agitado (vórtex) por 1 min. Esperou-se a separação das fases, coletando-se o sobrenadante (fase hexânica), para posterior evaporação. O resíduo obtido foi diluído em 2 mL de acetonitrila e isopropanol, na proporção 95:5 (fase móvel). O resíduo diluído na fase móvel foi filtrado através de membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com diâmetro do poro de 0,45 μm e analisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com detector de arranjo de diodos (DAD). Foi utilizado cromatógrafo líquido da marca Shimadzu (Japão), equipado com sistema quaternário de bombas, degaseificador, válvula de injeção com alça de amostragem de 20µL, coluna analítica de fase reversa C18 acoplada ao forno de coluna e detector de arranjo de diodos. O colesterol e o óxido 25- hidroxicolesterol, foram separados em coluna analítica de fase reversa C18 (15 cm x 6 mm d.i. x 5m) da marca Restek. Como fase móvel, foi utilizada uma mistura de solventes acetonitrila e isopropanol na proporção 95:5(v/v), sendo estes de pureza cromatográfica. Os valores e dados foram determinados através do software LC Solution®. Para a otimização do método, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado de ordem 2^5-1, tendo como fatores, aqui também chamada de variáveis, o volume da solução de KOH (V. KOH), o volume de álcool (V.ÁLCOOL), o volume de água adicionada à amostra (V. ÁGUA), o volume de Hexano (V.HEXANO) e o tempo de repouso (T. REPOUSO), proporcionando 16 experimentos com pontos inferiores (-1) e superiores (+1) e 3 repetições do ponto central, totalizando dessa forma 19 ensaios. E com isso, os dados foram analisados por meio do uso do software Statistica 6.0.

Resultado e discussão

Os fatores em estudo (Tabela 1) foram analisados quanto ao nível de superioridade e inferioridade e as possíveis combinações desses níveis para então ser definida a melhor condição experimental. Pode ser observado na Tabela 1 que para a variável (V. KOH), o volume da solução variou de 3 a 5 mL com o intervalo de 1 mL entre si, para (V. ÁLCOOL) variou de 4 a 8 mL com o intervalo de 2 mL, para (V.ÁGUA) de 4 a 6 mL com espaço de 1 mL e (V. HEXANO) de 8 a 12 mL com o intervalo de 2 mL entre si. Também foi analisado o tempo de repouso entre 20 e 24 horas, com intervalo de 2 h entre os níveis. Foi verificada a ocorrência do 25-hidroxicolesterol nas amostras de leite em pó de búfala, assim como também o colesterol foi detectado. As áreas dos picos a partir das injeções cromatográficas foram calculadas de forma a gerar gráficos de Pareto, possibilitando a identificação dos fatores que influenciam na extração do colesterol e seus óxidos nas amostras do leite em pó de búfala. O diagrama de Pareto apresenta os efeitos padronizados (valores absolutos calculados por meio da distribuição t de Student) de cada parâmetro, sendo estes considerados relevantes se forem estatisticamente significativos; ou seja, quando o efeito padronizado do parâmetro for inferior ao p-valor (probabilidade de significância) de 0,05, para 95% de confiança (RODRIGUES e IEMMA, p.326, 2005). Os resultados referentes ao planejamento fatorial fracionado são melhores observados no diagrama de Pareto (Figura 1). A linha vertical (p=0,05) sugere a menor magnitude dos efeitos estatisticamente expressivos na análise em questão, o que permitiu verificar que nenhuma das variáveis influenciou no processo de extração tanto para o colesterol quanto para o óxido. Como se trata de otimizar a metodologia já proposta, espera-se que (p>0,05), ou seja, não significativo. Resultado este, encontrado no trabalho, onde as variáveis em questão não apresentaram nenhuma implicação no processo de extração, o que faz com que a metodologia proposta por Saldanha et al. (p.4108, 2006) possa ser bem aplicada para a amostra do leite em pó de búfala. As variáveis e suas interações são colocadas verticalmente da mais significativa para a menos significativa. O resultado abaixo nos mostra que seguindo as barras horizontais de cima para baixo para a análise do óxido de colesterol (Figura 1- a), o volume de água (V. ÁGUA) é o fator mais significativo, logo sendo o fator mais importante do experimento, e em seguida o fator volume de KOH (V.KOH), e assim sucessivamente o gráfico nos indica como ocorrem os efeitos. Para o colesterol (Figura 1-b) o fator mais significativo foi o volume de KOH (V. KOH) seguido do fator (V. HEXANO) e assim consecutivamente. Segundo Millioli (p.200, 2009), os efeitos positivos indicam que os fatores devem ser usados no nível (+1) para que se obtenha melhor resposta do sistema. Os efeitos negativos indicam que os fatores devem ser usados no nível (-1). A partir do diagrama de Pareto pode-se fazer a otimização utilizando os fatores mais significativos, estudando separadamente com mais níveis, logo pode se obter mais informação do sistema. Com isso, é possível perceber (Figura 1), que tanto para a análise de colesterol quanto para o óxido, as variáveis (V.KOH) e (V.HEXANO) tenderam ao nível inferior (-1), ou seja, um menor volume adicionado favoreceu melhor resultado. E para as variáveis (V.ÁLCOOL), (T. REPOUSO) e (V. ÁGUA) os efeitos positivos (+1) indicaram a melhor resposta. Com isso, foi possível determinar que as condições ótimas para extração de colesterol e do óxido 25- hidroxicolesterol em amostras de leite de búfala em pó é a adição do volume de 3 mL de hidróxido de potássio, 8 mL de álcool etílico (PA), permanecendo em repouso por 24 h, adicionado posteriormente 6 mL de água, em seguida 8 mL de hexano. Estudos realizado por Bandeira et al. (p. 1424, 2008) no desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de colesterol em ração para ruminantes através de planejamento experimental fatorial verificaram que tempos inferiores a 23 h não eram suficientes para a completa dissolução e saponificação da amostra de ração. O que se assemelha com o resultado deste trabalho, onde o tempo de 24 h foi definido como a melhor condição na extração dos compostos. O uso do planejamento fatorial na otimização da metodologia é fundamental para uma visão mais detalhada das variáveis que realmente podem afetar o experimento realizado, possibilitando uma compreensão do que ocorre no experimento.

Diagrama de Pareto mostrando os efeitos positivos e negativos para as variáveis dos dois compostos 25- hidroxicolesterol (a) e o colesterol (b).


A tabela demostra os níveis inferiores e superiores, como também o ponto central para cada fator em estudo.

Conclusões

O planejamento fatorial estabelece quais os fatores que têm efeitos relevantes na resposta e, também, como o efeito de um fator varia com os níveis dos outros fatores. Permite ainda estabelecer e quantificar as correlações entre os diferentes fatores. O uso do planejamento fatorial permitiu concluir que nenhuma das variáveis testadas influenciou significativamente na extração do colesterol e óxidos do leite em pó. O fator mais importante para a extração do colesterol foi o volume da solução KOH (V. KOH), já para o óxido de colesterol o volume de água adicionada (V. ÁGUA) apresentou pelo diagrama de Pareto maior influência na metodologia. Os níveis de valores máximos (+1) e mínimos (-1) utilizados para avaliar o comportamento das variáveis foram essenciais, sendo possível observar a interação entre os fatores a cada ensaio. O procedimento que apresentou resultado de melhor condição de aplicação da metodologia, foi a utilização de 3 mL de KOH 50% com 8 mL de álcool etílico, permanecendo em repouso por 24 horas, e finalizando com a adição de 6 mL de água e 8 mL de hexano. A otimização da metodologia foi alcançada, permitindo que o colesterol e o óxido 25- hidroxicolesterol fossem detectados, identificados e quantificados na amostra do leite bubalino em pó por meio da cromatografia líquida de alta eficiência.

Agradecimentos

Referências

AL-ROWAILY, M. A. Effect of Processing Methods on Cholesterol Contents and Cholesterol Oxides Formation in Some Dairy Products. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 15, n. 1, p.35-45, jun. 2008.

BANDEIRA, M.C.; FERREIRA, J.M.; BRAGAGNOLO, N.; MARIUTTI, L.R.B. Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de colesterol em ração para ruminantes através de planejamento experimental fatorial. Revista Química Nova, vol. 31, n.6, p.1422-1426, São Paulo, 2008.

DIAS, S. da S. Avaliação da Qualidade e Autenticidade de Derivados de Leite de Búfala Encontrados no Varejo do Rio de Janeiro. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Setembro, 2009. 59 pag. Dissertação para obtenção de Mestre em Ciência de Alimentos.

GALDÁMEZ, E. V. C. Aplicação das técnicas de planejamento e análise de experimentos na melhoria da qualidade de um processo de fabricação de um produto plástico. Universidade de São Paulo, São Carlos, 2002. 133 pag. Dissertação para obtenção do título de Mestre em Engenharia de Produção.

GUARDIOLA, F.; CODONY, R.; ADDIS, P. B.; REFECAS, M.; BOATELLA, J. Biological effects of oxysterols: Current status. Food Chemistry and Toxicology, v. 34, p. 193-211, 1996.

MILLIOLI, V.S. Avaliação da potencialidade da utilização de surfactantes na biorremediação de solo contaminado com hidrocarbonetos de petróleo. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009, 200 pag. Tese para obtenção do título de Doutor em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.

MORALES-AIZPÚRUA, I. C.; TENUTA-FILHO, A. Óxidos de colesterol: ocorrência em alimentos, formação e efeitos biológicos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 38, n.4, p. 431-432, 2002.

ORCZEWSKA-DUDEK, S.; BEDERSKA-ŁOJEWSKA, D.; PIESZKA, M.; PIETRAS, M. P. Cholesterol and lipid peroxides in animal products and health implications – a review. Annals of Animal Science, v. 12, n. 1, p. 25-52, 2012.

RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F. Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos. Campinas: Casa do Pão Editora, 2005, 326 p.

SALDANHA, T.; SAWAYA, A. C. H. F.; EBERLIN, M. N.; BRAGAGNOLO, N. HPLC Separation and Determination of 12 Cholesterol Oxidation Products in Fish: Comparative Study of RI, UV, and APCI-MS Detectors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, n. 54, p. 4107-4113, 2006.

SALDANHA, T.; MAZALLI, M. R.; BRAGAGNOLO, N. Avaliação comparativa entre dois métodos para determinação do colesterol em carnes e leite. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v.24, n.1, p. 109-113, 2004.