DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA O ESTUDO FITOQUÍMICO DE Mammea americana

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Orgânica

Autores

Sampaio, G.C.D. (UFPA) ; Borges, L.C. (UFPA) ; Amorim, W.S. (UFPA) ; Silva, M.N. (UFPA)

Resumo

Uma planta medicinal é um vegetal que produz em seu metabolismo substâncias, em quantidade e qualidade, capazes de provocar modificações nas funções biológicas, e assim, melhorar, manter e recuperar um organismo doente. Essas substâncias são chamadas de princípios ativos. A principal classe de substância encontrada em Mammea americana (Gutíferas), são cumarinas, por conta destes metabolitos secundários têm surtido várias a cerca da planta por conta de suas propriedades: antioxidante, anticâncer, antiHIV, antifúngica, antibacteriana, antimicrobiana e antibiótica, assim como atividade inseticida. Em vista deste fato, neste estudo são desenvolvidos métodos cromatográficos para obtenção dos metabolitos secundário presentes na planta.

Palavras chaves

produtos naturais; cromatografia; cumarinas

Introdução

Desde a pré-história as plantas são utilizadas para amenizar dores e tratar moléstias. O homem procurou aproveitar os princípios ativos existentes nos vegetais, embora de modo totalmente empírico ou intuitivo, baseado em descobertas ao acaso. Isto pode ser observado entre povos ainda em estágio muito primitivo, por exemplo, os Papuas Australianos e algumas tribos indígenas da América do Sul. Na Bíblia, tanto no Antigo como no Novo Testamento, há muitas referências de plantas curativas, como por exemplo, o benjoim, a mirra e diversos bálsamos (BERG et al, p. 13-14, 1993). Em todas as partes do mundo estão sendo reativas as pesquisas sobre os produtos de origem natural. Há uma demanda cada vez maior de novas fontes naturais de nutrientes e medicamentos. No que se refere aos medicamentos, os efeitos colaterais causados pelos fármacos sintéticos vêm preocupando a medicina atual e estimulando o aproveitamento de drogas de origem vegetal. Para atender a essa procura, a Amazônia brasileira oferece um apreciável potencial devido ao grande número de espécies disponíveis, muitas delas, empregadas popularmente pelas populações amazônicas (BERG et al, p. 94-104, 993). A M. americana é nativa das Antilhas e norte da América do Sul, é conhecida popularmente como, abricódo- Pará, abricó, abricó de São Domingos e mammea maçã (CORREA et al, p. 11-12, 1994). Estudos recentes dessa espécie demonstram que ela apresenta substâncias da classe das cumarinas e outras poucas da classe dos flavonóides. Pesquisas realizadas neste vegetal demonstram que as cumarinas apresentam atividade inseticida, antioxidante, anticâncer, antiHIV, antifúngica, antibacteriana antimicrobiana e antibiótica (YANG et al, p. 4114, 2006). As cumarinas constituem uma classe de metabólitos secundários amplamente distribuídos no reino vegetal podendo também ser encontrados em fungos e bactérias. Estruturalmente são lactonas do ácido o-hidróxi-cinâmico (2H-1-benzopiran-2-onas) sendo o representante mais simples a cumarina. As cumarinas são derivadas do ácido cinâmico por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico (DEWICK et al, p. 151-156, 2001). A palavra cumarina tem origem do termo caribenho cumaru, nome popular de Dipteryx odorata (Aubl.), Fabaceae. A M. americana é nativa das Antilhas e norte da América do Sul e contém vasta quantidade de cumarinas e alguns flavonóides. Às cumarinas são atribuídas uma grande variedade de atividades farmacológicas, bioquímicas e terapêuticas, as quais dependem de seus padrões de substituição (YANG et al, p. 853, 2005). A importância deste estudo caracteriza-se em investigar a composição química da espécie M. americana; e desenvolver métodos a partir de técnicas cromatográficas clássicas e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência analítico e semi-preparativo que sejam eficientes para obtenção das substâncias.

Material e métodos

Equipamentos Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear carbono e de Hidrogênio, foram obtidos em espectrômetros Mercury Plus NMR, operando em 75 MHz para o carbono e 300 MHz para o 1H. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência analítico, da marca Shimadzu, constituído por uma bomba solenóide com quatro canais modelo LC-20AT, detector de arranjo de diodo modelo SPD-M20A detector de absorbância na região do ultra-violeta operando de 200 a 400 nm; degaseificador de membrana modelo DGU-20As, auto-injetor de amostras modelo SIL-20A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência semi-preparativo, da Shimadzu, composto por duas bombas, modelo LC-6 AD, degaseificador de membrana DGU-20A- SR, detector com duplo canal de absorbância na região do ultravioleta e do visível, modelo SPD-10AV, operando com comprimento de onda 254 nm, injetor de amostras Rheodyne 7752, com alça de amostragem de 200 e 500 μL. Interface de comunicação CBM-20A, acoplado a um microcomputador com software de integração LC solution versão 1.25SP1. Materiais Em cromatografia líquida de alta eficiência utilizou-se como fase estacionária uma coluna Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) analítica. A coluna de segurança ou pré-coluna foi um HOLDER® bicompartilhado contendo, em seu interior, um cartucho de segurança C18 (4 x 30 mm, 5 µm), adquirido da Phenomenex® (Torrance, CA, USA). Foram utilizados como reveladores: soluções aquosas de sulfato cérico. Nas separações cromatográficas em coluna, foi utilizada como adsorvente sílica gel (60-200 µm) da SilicaFlash®G60. Solventes grau HPLC: metanol e acetonitrila; solventes grau ACS: acetona, hexano, etanol e metanol; a água foi purificada em um sistema de água Millipore e as fases móveis foram passadas em um filtro de membrana de nylon com poros de 0,45 µm. Os solventes deuterados usados em espectroscopia de RMN foram da marca Tedia. Os frutos de Mammea americana foram coletados na fazenda do Sr. Masanori Yoshioka, Castanhal, município do Estado do Pará, no período de 22 à 30 de dezembro de 2013. A identificação botânica foi feita por pesquisador da Embrapa Amazônia Oriental (Pará-Brasil).

Resultado e discussão

As amêndoas de M. americana foram secas em estufa com temperatura máxima de 50ºC, em um período de quatro dias, sendo posteriormente trituradas em moinho de facas, resultando em um total de 100 g do material seco e moído. Este material foi submetido a duas extrações por percolação com 0,5 L de etanol grau PA, em um tempo fixo de 2 dias por 24 horas, seguido de filtração e evaporação em evaporador rotativo, mantendo a temperatura do banho-maria em 45° C, obtendo-se 4,5 g de extrato etanólico. Com base na análise de CCDC – cromatografia em camada delgada comparativa realizada em uma alíquota da amostra, foi possível obter resultados fundamentais para realização de um fracionamento do extrato etanólico em CCVU - Coluna Cromatográfica por Via Úmida, utilizando sistemas de solventes com polaridade crescente. Uma fração que foi obtida nesta coluna no sistema Hex/Acetona (94:6), rendeu uma massa igual a 1,745 g. Com o objetivo de se obter um perfil cromatográfico, uma alíquota de 1 mg desta amostra foi injetada em CLAE em modo gradiente com fase móvel composta por solvente A = H2O e B = ACN, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico, no tempo de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/minuto. Pela estimativa do % do solvente B para eluição isocrática, baseada no tempo de retenção da última banda trz do gradiente inicial (CASS et al, p. 46-48, 2011); foi sugerido um sistema isocrático. O sistema escolhido para iniciar as analises foi H2O/ACN 14:86. Após a realização da análise, percebeu-se que o sistema não foi satisfatório; para prosseguir o desenvolvimento do método de separação, foi utilizado o nomógrafo da seletividade (CASS et al, p. 46-482011) para realização de analises com fase móvel composta por solvente mais fraco. Assim foi constituída a fase móvel em H2O:MeOH (12:88). Apesar da obtenção de um bom cromatograma, observou-se a existência de muitos constituintes, o que dificultaria o isolamento por CLAE, por isso foi necessário refracionar a fração. Através do refracionamento em CCVU da qual foi obtida uma fração no sistema Hex/Acetona (94:6), (237 mg), que foi analisada no sistema isocrático H2O:MeOH (12:88), onde o cromatograma demonstrou boa seletividade dos constituintes químicos da amostra. Entretanto, houve a necessidade de ajustar o modificador orgânico para otimizar o método de isolamento. O sistema H2O:MeOH (20:80) foi o mais satisfatório para o isolamento de quatro substâncias da classe das cumarinas. A determinação estrutural da substância S1 (Fig. 1)foi realizada com base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1H, 13C e por comparação com informações encontradas na literatura (Fig. 2), as outras substância não foram obtidas com massa suficiente para analise de espectrométrica de RMN de 13C para a elucidação estrutural, entretanto pelo espectro de RMN de 1H; S2, S3 e S4 são substâncias da classe das cumarinas.

Fig.: Eluição isocrática. Fase móvel composta por: H2O/MeOH 20:80. em um tempo de 0 a 60 min e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, λ= 235


1- Dados obtidos experimentalmente em CDCl3. 2- Dados da literatura em CDCl3 (RICARDO et al., 2004) 3- Dados da literatura em CDCl3 (YANG et al., 2005

Conclusões

Neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico do extrato etanólico da semente de Mammea americana que utilizando técnicas cromatográficas de CCDC, CCVU e CLAE, que levaram ao desenvolvimento de métodos cromatográficos para obtenção dos metabólitos secundário presentes na planta e o isolamento e caracterização da substância, 4-propil-6-prenila-5 isopentiloxidadodihidroxicumarina, pertencente a classe das cumarinas. A qual foi identificada por análise de dados espectroscópicos de RMN e por comparação com dados da literatura. É relatado na literatura, a utilização do sistema binário H2O/ACN para o desenvolvimento de um método por HPLC para isolamento dos constituintes químicos de M. americana, porém neste trabalho foi possível isolar os compostos utilizando H2O/MeOH, e tornando assim o processo mais econômico e viável financeiramente, pois o valor da acetonitrila é em média quatro vezes maior que do metanol.No método desenvolvido o tempo decorrido para obtenção dos componentes puros está na faixa de tempo encontrada na literatura, que é de 60 minutos; o qual poderia ser diminuído, porém a otimização deste método apresenta um excelente fator de separação dos compostos para que estes sejam obtidos na escala semi-preparativa ou preparativa.

Agradecimentos

Os autores deste trabalho agradecem, ao Sr. Masanori Yoshioka, a Embrapa Amazônia Oriental (Pará-Brasil) e ao Laboratório de Cromatografia Líquida (UFPA).

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