PRODUÇÃO DE LIPASES DE Aspergillus sp. ISOLADOS DE SEMENTES DE Jatropha curcas.

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Orgânica

Autores

Ribeiro Alves, D. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ, FORTALEZA-CE) ; Roger Vasconcelos, F. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, FORTALEZA – CE) ; Bernardo de Lima Coutinho, I. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, FORTALEZA – CE) ; Silva Lima, J. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, FORTALEZA – CE) ; Oliveira Targino, K. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ, FORTALEZA-CE) ; das Chagas de Oliveira Freire, F. (EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, FORTALEZA – CE) ; Maia Morais, S. (UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ, FORTALEZA-CE)

Resumo

Lipases (3.1.1.3) catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos. Enzimas de fungos endofiticos são estáveis, eficientes, especificas e fáceis de produção em massa. Os fungos foram isolados em placas com BDA e inoculados pellets de 6mm em meio enzimático. O Índice Enzimático (IE) foi calculado após 5 dias de inoculação. O maior valor de IE foi observado em cepas de Emericella nidullans quando se utilizou o Tween 20 como substrato e Aspergillus sp. quando se utilizou o Tween 80. Esses resultados são maiores quando comparado-os aos dados reportados da literatura. Ainda, se fazem necessários novos estudos para determinar o modelo de otimização da produção desta enzima, relacionando-a com temperatura de incubação e/ou concentrações de nutrientes e variações do pH.

Palavras chaves

enzimas; fungos endofíticos; Tween 20 e 80

Introdução

Lipases (3.1.1.3) são enzimas que possuem a função de catalisar a hidrólise de triacilgliceróis aos ácidos graxos correspondentes e glicerol (HOSHINO et al,1999). As Lipases são enzimas pertencentes à subclasse das hidrolases, um grupo de enzimas que catalisam a quebra de ligações de moléculas através de reação com água (BORNSCHEUVER & KASLAUSKAS, 2005). Algumas lipases microbianas apresentam algumas características como regioenantioseletividade, estabilidade a altas temperaturas e a ampla faixa de pH que fazem com que essas enzimas sejam mais vantajosas em relação às de origem animal e vegetal (BORNSCHEUVER & KASLAUSKAS, 2005). Existe um interesse em particular sobre a obtenção de lipases de fungos filamentosos pois suas enzimas são, na maioria das vezes, extracelulares, o que facilita a recuperação das mesmas (CARVALHO et al, 2005).Os fungos isolados no território brasileiro têm se mostrado excelentes fontes de lipases (MAGALHÃES, 2011). As outras vantagens de microorganismos são o alto rendimento de conversão de substrato em produto, grande versatilidade de condições ambientais e, simplicidade de manipulação genética e em condições de cultivo (RIBEIRO et al, 2011). Lipases bacterianas e fúngicas são usados na produção de biodiesel, tais como Aspergillus niger. (YAHYA, ANDERSON, MOO-YOUNG, 1998). Tendo em vista que fungos endofíticos possivelmente teriam melhor atividade lipolítica se provenientes de plantas oleaginosas, buscou-se na literatura plantas provenientes do bioma Caatinga. O presente trabalho objetiva investigar enzimas com atividade lipolítica proveniente de Aspergillus sp. endofíticos de oleaginosas da caatinga brasileira, isolados e armazenados no laboratório de Fitopatologia da EMBRAPA Agroindústria Tropical, para a possível produção de biodiesel.

Material e métodos

O experimento foi realizado na Embrapa Agroindústria localizada na Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza-CE. Foram utilizados para esta avaliação 05 unidades/placa de sementes de Jatropha curcas L. com e sem desinfestação dispostas em 30 placas descartáveis com BDA (Batata Dextrose Agar). Os fungos foram isolados após 03 dias em placas descartáveis com BDA e após 05 dias das cepas do gênero Aspergillus sp. foram inoculados pellets de 6mm de diâmetro em meio enzimático. Foi utilizado o meio base composto por (g.L-1): peptona 6,0, NaCl 3,0, CaCl2·2H2O 0,06, Agar 10,8, pH 7.4. Como indutores de atividade enzimática foi adicionado Tween 20 1% (v/v; T20) e o Tween 80 1% (v/v, T80) (VIEIRA et al, 2006). A atividade lipolítica do fungo foi observada, utilizando lupa e microscópio, pela formação de um precipitado cristais de sais de cálcio ou com um halo claro deste precipitado ao redor das colônias. Os fungos foram inoculados no centro das placas de Petri com auxilio de uma alça de platina esterilizada. Essas placas foram mantidas em estufa bacteriológica, por 10 dias a 27°C. Diariamente foram observados os crescimentos e medido o tamanho da colônia e do halo, quando presente. Como controle positivo do teste, foram utilizadas as cepas bacterianas Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. Foi determinado o Índice Enzimático (IE) fazendo a relação do diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia mais o halo dos cristais de cálcio (HANKIN, ANAGNOSTAKIS, 1975) após 03 dias do repique. de Stiers). Se o índice enzimático for maior do que 1, melhor a produção da enzima de interesse (RODRIGUES, 2009).

Resultado e discussão

No intuito de avaliar a capacidade de produzir atividade lipolítica os fungos provenientes das sementes de pinhão manso foram ensaiados em meio especifico, utilizando dois substratos (Tween 20 e Tween 80). A atividade lipolítica foi observada em todos os microrganismos testados, sendo que o maior valor de IE foi observado em cepas de que foram caracterizadas como Aspergillus sp, quando se utilizou o Tween 20 como substrato e dois isolados de Emericella nidulans quando se utilizou o Tween 80, sendo este valor superior a todos os outros. O menor IE foi observado pelo mesmo isolado utilizando-se o Tween 20 como substrato. Foi observado que as espécies cultivadas obtiveram um resultado diverso em relação à produção de atividade lipolítica, podendo ser positiva em um meio e negativa em outro, positiva ou negativa em ambos os meios, apresentando crescimento gradual durante os 6 dias de observação. Os dados de todas as cepas estão representados na tabela1. Lipases atuam em reações de esterificação como a reação de transesterificação para produzir ésteres metílicos (biodiesel) (YUCEL, TERZIOGLU, OZÇIMEN, 2012). Foram desenvolvidas lipases por modificações físicas e técnicas de expressão do gene mais económicas, ativas, seletivas ou estáveis (VILLENEUVE et al, 2000). Em comparação com processos enzimáticos convencionais, o uso de células integrais fornece excelente estabilidade operacional e evita os complexos procedimentos de isolamento, purificação e imobilização (FUKUDA et al, 2008 e LI et al, 2008).Os resultados encontrados de produção enzimática para fungos endofíticos de Jatropha curcas L. são similares, e em alguns casos superiores, ao que foi reportado na literatura. (NATH; HINDUMATHY, 2012; SABAT et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2013; CHAPLA et al., 2013).

Conclusões

Esses resultados demonstram o potencial lipolítico das cepas mantidas na micoteca do laboratório de Fitopatologia. Entretanto, faz-se necessário outros estudos para determinar um modelo de otimização da produção enzimática, relacionando com outras variáveis independentes, como temperatura de incubação e/ou concentrações de nutrientes, variação de fonte de carbono e variações do pH, com o intuito de diminuir o custo efetivo de produção.

Agradecimentos

Ao CNPQ e a EMBRAPA Agroindústria Tropical.

Referências

BORNSCHEUER, U. T.; KASLAUSKAS, R. J. Hydrolases in Organic Synthesis: Regioand Stereoselective Biotransformations. 2ª ed., Wiley-VCH, 2005.

CARVALHO, P. O.; CALAFATTI, S. A.; MARASSI, M.; SILVA, D. M.; COSTESINI, F. J.; BIZACO, R.; MACEDO, G. A. Potencial de biocatálise enantiosseletiva de lipases microbianas. Química Nova, v.28, n.4, p.614-621, 2005.

CHAPLA, V. M.; BIASETTO, C. R.; ARAUJO, A. R. Fungos Endofíticos : Uma Fonte Inexplorada e Sustentável de Novos e Bioativos Produtos Naturais Endophytic Fungi : An Unexplored and Sustainable Source of New and Bioactive Natural Products Fungos Endofíticos : Uma Fonte Inexplorada e Sustentável de Novos e Bioativos Produtos Naturais. , v. 5, n. 3, p. 421–437, 2013.

FUKUDA H.; HAMA S.; TAMALAMPUDI S.; NODA H. Whole-cell biocatalysts for biodiesel fuel production. Trends in Biotechnology. v. 26, p. 12, 2008.

HOSHINO, T.; YAMANE, T.; SHIMIZU, S. Agric. Biol. Chem. v.54, p.1459, 1999. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000183&pid =S0100-4042199900060001400036&lng=en>. Acesso em: 19 de julho de 2015.

LI W.; DU W.; LIU D.; YAO Y. Study on factors influencing stability of whole cell during biodiesel production in solvent-free and tert-butanol system. Biochemical Engineering Journal. v. 41, p. 111-115, 2008.

MAGALHÃES, F. E. A. Potencial biotecnológico de fungos isolados do molusco Pugilina morio. Universidade Estadual do Ceará, (UECE) Fortaleza, CE, Brasil, 2011. p. 151. (Tese de Doutorado: Biotecnologia).

NATH, M.; HINDUMATHY, C. K. ISOLATION , OPTIMIZATION AND PURIFICATION. International Journal of Latest Research in Science and Technology, v. 1, n. 3, p. 239–246, 2012.

OLIVEIRA, E. S. DE; MEDEIROS, S. F.; GAGLIARDI, P. R. FUNGOS ASSOCIADOS A SEMENTES DE PINHÃO MANSO (JATROPHA CURCAS L.). Essentia, v. 15, n. 1, p. 53–70, 2013.

RIBEIRO B. D.; DE CASTRO A. M.; COELHO M. A. Z.; FREIRE D. M. G. Production and Use of Lipases in Bioenergy: A Review from the Feedstocks to Biodiesel Production. Enzyme Research. p. 1-16, 2011.

RODRIGUES, A. A. Atividade antimicrobiana e produção de enzimas de interesse biotecnológico de bactérias isoladas de diferentes habitats., 2009. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS.

SABAT, S.; MURTHY, V. K.; PAVITHRA, M.; et al. Production and characterisation of extracellular lipase from Bacillus stearothermophilus MTCC 37 under different fermentation conditions. Journal of Engineering Research and Applications (IJERA) ISSN:, v. 2, n. 3, p. 1775–1781, 2012.

VIEIRA, T. M. .; SILVA, E. P. .; FILHO, N. R. A. .; VIEIRA, J. D. G. Determinação e quantificação da degradação bacteriana de biodiesel de óleo de palma. In: Anais.. (Ed.); CONGRESSO DA REDE BRASILEIRA DE TECNOLOGIA DE BIODIESEL. Anais... p.218–223, 2006. Brasilia, DF: Prossiga/IBICT.

VILLENEUVE P.; MUDERHWA J. M.; GRAILLE J.; HAAS M. J. Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. v. 9, p. 113-148, 2000.

YAHYA A. R. M.; ANDERSON W. A.; MOO-YOUNG M. Ester synthesis in lipase catalyzed reactions. Enzyme and Microbial Technology. v.23, p.438-450, 1998.

YUCEL S.; TERZIOGLU P.; OZÇIMEN D. Aplicações lipase na Produção de Biodiesel. Biodiesel - Matérias-Primas, Produção e Aplicações, Ed. Zhen Fang. 2012
DOI: 10,5772 / 52.662.