DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO VIA CLEA PARA OBTENÇÃO DE FLAVONÓIDES A PARTIR DO EXTRATO METANÓLICO DE Thuya occidentalis

ISBN 978-85-85905-15-6

Área

Química Orgânica

Autores

Sampaio, G.C.D. (UFPA) ; Borges, L.C. (UFPA) ; Amorim, W.S. (UFPA) ; Silva, M.N. (UFPA)

Resumo

Thuja occidentalis (Cupressaceae), é usada principalmente como fitoterápico, na forma de capsulas, tintura ou diluição; baseando-se em evidências fitoterápicas para infecções agudas e crônicas do trato respiratório superior, e como um ativo principal para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. Por tanto se faz necessária a investigação química da planta para determinar, que ou quais compostos lhe confere estas bioatividades, assim foi possível obter a partir de dois procedimento de pré-tratamento da amostra e tratamento em CLAE substâncias da classe dos flavonóides; estes pertencem a uma classe de compostos naturais de considerável interesse científico e terapêutico.

Palavras chaves

cromatografia; plantas medicinais; metabólitos secundários

Introdução

Thuya occidentalis é uma planta da família das Cupressaceae, também conhecida como pinheiro de cemitério, árvore-da-vida, cedrinho, ciprestes, tuia americana. Trata-se de árvore frondosa, de ramos folhosos mais ou menos horizontais e com copa no formato de pirâmide. Seu crescimento é lento e pode atingir até 20 metros de altura. Os ameríndios usavam a tuia para problemas como dores de cabeça, febre e reumatismo e queimavam-na para "limpar" o ar. Atualmente, ela é usada principalmente como fitoterápico, na forma de capsulas, tintura ou diluição. Em combinação com outras plantas imunomoduladores; esta planta medicinal também é usada como baseada em evidências fitoterapia para infecções agudas e crônicas do trato respiratório superior, e como um princípio ativo para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. A tuia é sobre tudo usada em verrugas, embora seja útil em outros problemas infecciosos, especialmente na sinusite, abcessos nos dentes, bronquite, cistite e infecções fúngicas (NASER et al, p. 70, 2005). A determinação de propriedades bioativas de plantas é muito importante para aplicações farmacológicas. É através de estudos fitoquímicos que novas drogas são descobertas. As investigações fitoquímicas são muito complexas e se utilizam de técnicas clássicas de extração/purificação/separação que são efetuados para isolar e elucidar compostos bioativos. Até que seja totalmente desvendada a estrutura que promove tal atividade leva-se muito tempo, principalmente quando não dá relatos na literatura sobre a espécie a ser estudada (Brusotti et al, p. 219, 2013). Para conseguir obter um estudo minucioso a cerca desta amostra, minimizando as dificuldades que um estudo fitoquímico normalmente apresenta foi realizado dois pré-tratamento na amostra que tornou o procedimento de isolamento das substancia presentes no extrato de T. occidentalis mais rápido e econômico. Os flavonóides são pigmentos presentes nos vegetais que ocorrem naturalmente para proteger o organismo contra danos produzido por agentes, tais como os raios ultravioleta oxidante, poluição ambiental, produtos químicos em alimentos, etc. O organismo humano não produz esses produtos químicos protetores, então eles devem ser obtidos através da alimentação ou como suplementos alimentares. Eles são amplamente distribuídos em plantas, frutas, legumes e em várias bebidas e representam componentes substânciais da parte não energética da dieta humana. Os flavonóides contêm na sua estrutura química um número variável de grupos hidroxilo fenólicos e excelentes propriedades e outros agentes quelantes de ferro metais de transição, o que lhes dá uma grande capacidade antioxidante. Por isso, desempenhar um papel essencial na proteção contra os fenômenos danos oxidativos, e ter efeitos terapêuticos em grande número de doenças, incluindo doenças cardíacas, isquêmica, aterosclerose ou câncer (FLÓREZ et al, p. 271-272, 2002). A importância deste estudo caracteriza-se em investigar a composição química das partes aéreas de Thuya occidentalis; e desenvolver, tratamento de amostra e métodos cromatográficos via CLAE semi-preparativo que sejam eficientes para obtenção das substâncias puras, em menor espaço de tempo e com menor custo.

Material e métodos

Equipamentos Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio, foram obtidos em espectrômetros Mercury Plus NMR, operando em 300 MHz para o 1H. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência analítico, da marca Shimadzu, constituído por uma bomba solenóide com quatro canais modelo LC-20AT, detector de arranjo de diodo modelo SPD-M20A detector de absorbância na região do ultra-violeta operando de 200 a 400 nm; degaseificador de membrana modelo DGU-20As, auto-injetor de amostras modelo SIL-20A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência semi-preparativo, da Shimadzu, composto por duas bombas, modelo LC-6 AD, degaseificador de membrana DGU-20A- SR, detector com duplo canal de absorbância na região do ultravioleta e do visível, modelo SPD-10AV, operando com comprimento de onda 254 nm, injetor de amostras Rheodyne 7752, com alça de amostragem de 200 e 500 μL. Interface de comunicação CBM-20A, acoplado a um microcomputador com software de integração LC solution versão 1.25SP1. Materiais Para o tratamento das amostras (clean up) foram utilizados cartuchos com fase estacionária C18 (polimérico), todos da Phenomenex. Em cromatografia líquida de alta eficiência utilizou-se como fase estacionária uma coluna Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) analítica. A coluna de segurança ou pré-coluna foi um HOLDER® bicompartilhado contendo, em seu interior, um cartucho de segurança C18 (4 x 30 mm, 5 µm), adquirido da Phenomenex® (Torrance, CA, USA). Solventes grau HPLC: metanol e acetonitrila; solventes grau ACS: diclorometano e metanol A água foi purificada em um sistema de água Millipore e as fases móveis foram passadas em um filtro de membrana de nylon com poros de 0,45 µm. Os solventes deuterados usados em espectroscopia de RMN foram da marca Tedia. A amostra foi coletada em Itajai Santa Catarina; a identificação botânica foi feita por comparação com exsicata, do herbário virtual REFLORA. Extração dos constituintes químicos A amostra foi submetida ao processo de secagem em estufa a 40ºC durante seis dias para retirada de umidade, obtendo-se assim 15g de material seco e triturado. Este material foi submetido ao pré-tratamento passando por duas extrações por maceração num período de 24 horas com 100mL de diclorometano grau ACS; após filtração e evaporação completa do solvente agregado a amostra; este passou por duas extrações por maceração com 100mL de metanol grau ACS, em um tempo fixo de 2 dias x 24 horas, seguido de filtração simples e evaporação em evaporador rotativo, mantendo a temperatura do banho-maria em 45° C, obtendo-se 2,25g de extrato metanólico. Análise dos constituintes químicos Uma alíquota de 1 mg do extrato foi injetada em CLAE analítico em modo gradiente com fase móvel composta por solvente A = H2O e B = ACN, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico, no tempo de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/minuto.

Resultado e discussão

Pela estimativa do % do solvente B para eluição isocrática, baseada no tempo de retenção da última banda trz do gradiente inicial (CASS et al, p. 46-46, 2011); Considerando o estudo de SNYDER e colaboradores (1997), é possível propor valores desejáveis para o fator de retenção k (k=5; k=10; k=20), com base nos tempos de retenção da última banda. O tempo de retenção da última banda para o extrato metanólico de T. occidentalis foi próximo a 25 minutos. Com isso, foi calculado um valor teórico baseado nos estudos de SNYDER. Para se estimar um valor de percentual do modificador orgânico, optou-se por uma separação com k=20 e foi sugerido um sistema isocrático. O sistema escolhido para iniciar as analises foi H2O/ACN 70:30; o cromatograma não demostrou boa seletividade para os componentes da amostra, se fez necessário enfraquecer o modificador orgânico em percentual de cinco, dez, quinze; porém o aumento no princípio da hidrofobicidade que confere a separação em CLAE foi inversamente proporcional a resolução do cromatograma. Mediante as análises foi possível perceber que picos correspondentes aos compostos majoritários estavam demonstrando um alargamento na banda, o que é indicativo de substâncias que conforme a eluição com a fase móvel transformam-se na sua forma ionizada. Por tanto os solventes foram levemente acidificados com ácido fórmico à 0,1%, tornando assim o sistema de fase móvel constituído por H2O/ACN 70:30 à 0,1% de ácido fórmico. Este demonstrou-se eficiente para separação dos constituintes; entretanto, houve a necessidade de ajustar o modificador orgânico para otimizar o método de isolamento. O sistema H2O/ACN 80:20 à 0,1% de ácido fórmico foi o mais satisfatório método para a obtenção dos três flavonóides. O resultado pode ser observado no cromatograma (Fig. 1). Os componentes químicos que estão marcados no cromatograma possuem espectro na região do ultravioleta UVmax 255nm e UVmax 348nm, avaliando este resultado com trabalhos já realizados no LabCrol e por dados da literatura (Zhu et al, p. 15653-15654, 2013), que este espectro é característico de substância que pertencem a classe dos flavonóides. Estudos químicos publicados que são realizados em amostras de Thuya occidentalis, estão focados quanto a caracterização de óleos essências; este estudo fitoquímico desenvolve método de isolamento de compostos presentes na amostra, sendo de fundamental importância a grupos de pesquisa na área de bioatividades de compostos orgânicos, já que nestas pesquisas o material botânico tem demostrado promissores resultados quanto a suas ações: relaxante musculas, anti convulsão (LOKESH et al, p. 146, 2011); anti viral: anti HIV 1 e anti influenza A (NASER et al, p. 71-74, 2005); anti microbiana (TSIRI et al, p. 4711-4712, 2009); entre outras; a obtenção das substancias puras e a determinação estrutural das mesmas favorece a avaliação quanto a bioatividade referente a cada composto. O espectro de RMN de hidrogênio das substâncias demostraram valores de deslocamentos químicos característicos de flavonóides, confirmando o que foi observado no espectro na região do ultravioleta. Comparando o RMN 1H dos compostos obtidos com dados obtidos na literatura (MOREIRA et al, p. 310-311, 2003); os compostos são glicosídeos de flavonóides do tipo flavona.

Eluição isocrática. Fase móvel composta por: H2O/ACN 80:20 à 0,1% de ác. em um tempo de 0 a 35 min e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, λ= 254 nm.


Estrutura química do composto isolado, composto 2, quercetina-3-raminosídio.

Conclusões

No estudo fitoquímico das partes aéreas de T. occidentalis foram desenvolvidos métodos de pré-tratamento de amostra no qual é possivel obter três flavonóides presentes na planta de Thuya occidentalis, de forma mais rápida, eficiente e econômica. No que se refere ao processo de isolamento e identificação de constituintes químicos de Thuya occidentalis, o uso de técnicas cromatográficas mostrou-se adequada para separação de compostos estruturalmente semelhantes. O composto 1 foi obtido, porem não está no grau de pureza adequado para analise de RMN de 13C o que permitiria a caracterização estrutural exata; e do composto 3 obteve-se pouca massa, o que torna inviável a analise em espectrômetro de RMN, entretanto o espectro de hidrogênio dos compostos 1 e 3 demostraram valores de deslocamentos químicos característico de flavonóides. A determinação estrutural do composto 2, quercetina-3-raminosídio foi realizado com base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1H, 13C e por comparação com informações encontradas na literatura.

Agradecimentos

Os autores deste trabalho agradecem, à Central de Extração (UFPA) e ao Laboratório de Cromatografia Líquida da UFPA pela infra-estrutura que possibilitou a execução deste

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