Degradação de Deoxinivalenol por ação da Peroxidase quantificado por LC-MS/MS

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Química Analítica

Autores

Penteado Feltrin, A.C. (FURG) ; Garcia, S. (FURG) ; Caldas, S. (FURG) ; Primel, E.G. (FURG) ; Garda-buffon, J. (FURG)

Resumo

Deoxinivalenol (DON), micotoxina encontrada como contaminante de matrizes alimentares, possui em sua estrutura um anel epóxido que lhe confere toxicidade. A enzima Peroxidase (PO), enzima oxidativa, pode atuar sob o anel epóxido presente na estrutura resultando na detoxificação. Neste trabalho, foi avaliado o emprego da PO, bem como a ação de componentes do meio reacional como o substrato guaiacol e o cofator peróxido de hidrogênio (H2O2), verificando a redução da contaminação da micotoxina DON, quantificado por LC-MS/MS. Os resultados demonstraram que após 0,5 e 1 h de ação enzimática, a concentração de DON reduziu em 40 e 55% quando na presença do cofator H2O2. Esses resultados evidenciam a possibilidade de aplicação da PO na redução e descontaminação de DON.

Palavras chaves

Deoxinivalenol; Peroxidase; Degradação

Introdução

Deoxinivalenol (DON) é uma micotoxina produzida por espécies fúngicas toxigênicas pertencentes ao gênero Fusarium, principais contaminantes de milho, trigo e cevada, matérias-primas para a produção de alimentos.DON é um composto químico que possui em sua estrutura um anel epóxido que lhe confere alta toxicidade pelo efeito de inibição da síntese protéica em diferentes pontos. Como consequência, os tecidos mais afetados são os que apresentam maior divisão celular (DÖLL et al., 2009). As estratégias de degradação de DON visam remover ou reduzir suas concentrações a níveis aceitáveis. Reações de transformação em tricotecenos incluem oxidação, redução, hidrólise, hidratação e conjugação (HE et al., 2010). A maior parte de estudos relacionados a degradação de poluentes orgânicos envolve reações de oxidação, sendo que o emprego de enzimas vem despertando o interesse de pesquisadores pelas vantagens de aplicação em processos industriais (KARIM e HUSAIN, 2009). Em vista disso, técnicas de degradação de micotoxinas por vias enzimáticas vêm se destacando por sua simplicidade e manutenção das características funcionais e químicas de alimentos. Garda-Buffon, Kupski e Badiale-Furlong (2011) demonstraram que, durante fermentação submersa com Rhizopus oryzae e Aspergillus oryzae, a maior atividade da enzima PO estava diretamente relacionada com a maior velocidade de degradação da micotoxina. Com base nestes dados, o presente trabalhoavaliou o emprego da PO (grau comercial) visando a redução da concentração da micotoxina DON no meio tamponante.

Material e métodos

O padrão de DON e o padrão de PO obtida de raiz forte (HRP) foram adquiridos da Sigma Chemical Company (E.U.A.). O padrão enzimático de PO,foi empregado respeitando as condições descritas pelo fornecedor, utilizando tampão fosfato em pH 6 (5 mmol L-1) à temperatura ambiente (25 °C). A redução de DON foi verificada através de avaliação cinética com as seguintes condições reacionais: na presença da micotoxina e da enzima PO em meio tamponante, como também de componentes do meio reacional como o substrato de ação enzimática guaiacol, e o cofator para atividade enzimática, peróxido de hidrogênio (H2O2). Todos os experimentos foram comparados a um meio reacional controle contendo DON em meio tamponante. Os ensaios foram realizados em triplicata, em vidro âmbar fixando o volume total de 15 mL, além das concentrações de 4 μg mL-1 para DON, 8 μg mL-1 para H2O2, 4 μg mL-1 de guaiacol e 32,4 μg mL-1 de PO. A cada intervalo de tempo (0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 3; 5; 10; 24 e 48 h) foram retiradas alíquotas de 1 mL utilizada para a extração, concentração e quantificação da micotoxina em LC-MS/MS. As condições cromatográficas foram: coluna Kinetex(2,6 μm de partícula, 50 x 3 mm de diâmetro intermo),fase móvel composta por metanol:H2O ultrapura 5 mmol L-1 de acetato de amônio (70:30, v/v) com eluição no modo isocrático e uma vazão de 0,2 mL min-1. As condições no espectrômetro de massas foram otimizadas pela injeção da solução analítica do padrão de DON 1 μg mL-1 monitorado definindo massa molecular (296,3), modo de ionização da fonte (eletrospray negativo), energia de colisão (11/8), voltagem do cone (17/17), transição (m/z) e íon precursor e íon produto (355>58,8 e 355>295,2-este último usado para quantificação)

Resultado e discussão

A Figura 1 apresenta os resultados da redução de DON em relação ao tempo de exposição ao meio reacional (onde em meio tamponante, D – DON; DPOPG – DON, PO, guaiacol e H2O2; DPOP – DON, PO e H2O2; DPOG - DON, PO e guaiacol), encontrados durante avaliação da degradação de DON em meio tamponante. Nesta se observa que o ensaio realizado utilizando a enzima PO comercial denominado de DPOPG obteve, após 0,5 h de reação, uma redução na concentração de DON de 40%. Em ensaios na presença de H2O2, observa-se a redução da concentração de DON, que após 1 h de reação resulta em 55%,independente da presença de outro substrato como o guaiacol. A relação entre a maior redução de DON e a presença de H2O2nos experimentos DPOP e DPOPG, se dá por este ser um cofator enzimático desta enzima oxidativa, sendo sua presença no meio reacional de fundamental importância para a catálise. Porém, após 3 h de reação enzimática a concentração de DON correspondeu aos níveis iniciais, mantendo-se com pequena variação até o tempo final do experimento. Estes dados podem ser decorrente tanto do efeito de sorção e dessorção de DON pela enzima PO, que também pode influenciar na interação efetiva enzima/substrato, como também pela possibilidade da ação oxidativa enzimática sobre o grupo epóxido, formando um grupamento cetônico, caracterizado pela mesma massa molecular e polaridade, mas que representa de detoxificação da micotoxina. Estes dados evidenciam a necessidade de avaliação da cinética da enzima neste meio reacional, o que permitiria a caracterização da redução de DON por catálise enzimática, além da definição do mecanismo de ação. Além disto, é ressaltada a importância de estudos que visam a aplicação desta enzima na detoxificação de poluentes orgânicos que demonstram alto potencial tóxico a h

Concentração relativa de DON em relação ao tempo na avaliação da cinética de degradação de DON.

Conclusões

Assim, fica demonstrada a ação da enzima PO sobre a redução da concentração de DON, estes resultados podem indicar não só a metabolização pela enzima como também um efeito de adsorção. Portanto, faz-se necessária a avaliação de compostos de degradação de DON formados e a capacidade de adsorção da micotoxina pela proteína de PO visando a aplicação industrial.

Agradecimentos

FURG, EQA, CNPq, FAPERGS, LACOM e LAMCA.

Referências

DÖLL, S., SCHRICKX, J. A., DÄNICKE, S., FINK-GREMMELS, J. Deoxynivalenol-induced cytotoxicity, cytokines and related genes inunstimulated or lipopolysaccharide stimulated primary porcine macrophages. Toxicology Letters, v.184, 97–106, 2009.

HE, J.; ZHOU, T.; YOUNG, J. C.; BOLAND, G. J.; SCOTT, T. Chemical and biological transformations for detoxification of trichothecene mycotoxins in human and animal food chains: a review. Trends in Food Science & Technology. v. 21, p.67-76, 2010.

HAMID, M.; REHMAN, K. Potential applications of peroxidases. Food Chemistry. v. 115, p. 1177-1186, 2009.

GARDA-BUFFON, J.; KUPSKI, L.; BADIALE-FURLONG, E. Deoxynivalenol (DON) degradation and peroxidase enzyme activity in submerged fermentation. Ciência e Tecnologia de Alimentos. v. 3, p.198-20, 2011.