ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Química Analítica
Autores
Santos, D.S. (FUNDAÇÃO TÉCNICO EDUCACIONAL SOUZA MARQUES/FIOCRUZ) ; Tostes, J.B.F. (FIOCRUZ) ; Mazzei, J.L. (FIOCRUZ) ; Siani, A.C. (FIOCRUZ)
Resumo
Cascas de maçã contêm os ácidos ursólico (AU) e oleanólico (AO) que são farmacologicamente ativos tornando, então, relevante a determinação destes triterpenos em produtos comerciais, como o vinagre de maçã. Nesse estudo, a Extração em Fase Sólida (EFS) foi avaliada como técnica de enriquecimento e clean-up em fase estacionária C8 visando aumentar a sensibilidade na análise de AU e AO em vinagres de maçã. A seletividade de diferentes composições de solvente modificador (metanol) em eluente aquoso acidificado foi investigada. Alta especificidade e alta recuperação foram alcançadas em EFS-C8, uma vez que 60% de metanol permitiu eluir os pigmentos sem perda significativa dos ácidos enquanto que estes foram seletivamente eluídos por 90% de metanol.
Palavras chaves
Extração em fase sólida; Ácidos triterpênicos; Vinagre de maçã
Introdução
Cascas de diversas espécies de maçã contêm os ácidos ursólico (AU) e oleanólico (AO) dentre os constituintes lipofílicos. Esses triterpênicos pentacíclicos apresentam interessantes atividades farmacológicas, principalmente como anti-inflamatórios, antitumorais e anti-hepatite. Deste modo, a determinação destes ácidos torna-se relevante nos produtos comerciais de maçã que envolvam processamento do fruto com casca, como por exemplo o vinagre de maçã. No entanto, ensaios preliminares mostraram dificuldades na análise dos vinagres por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), após neutralização e liofilização, pela presença de muitos interferentes com retenção similar e mais elevada aos dos ácidos-alvo. É, portanto, relevante o desenvolvimento de uma metodologia de enriquecimento dos analitos de interesse. Dentre os métodos de preparação de amostra, a Extração em Fase Sólida (EFS) é adequada para o enriquecimento de AU e AO. Contudo, estes ácidos apresentam retenção mais elevada em fase estacionária C18 (STENHOLM et al, 2013) do que em fases com grupos aminopropil e com amônio quaternário quando aplicados em modo reverso (JANICSÁK et al, 2003). Retenção elevada em C18 foi obtida em <50% acetonitrila (solvente modificador) e eluição em >75% (SANTOS et al, 2013). A aplicação de eluentes ácidos contribuiria para melhor resolução na separação, mas implicaria em retenção mais elevada. Deste modo, a utilização de fase estacionária de cadeia menor, como C8 pode garantir alta recuperação. Assim, o presente trabalho aplica EFS com fase estacionária C8 em matriz de vinagre de maçã fortificada com AU e AO para avaliar a seletividade, visando à técnica de enriquecimento e análise de traços de AU e AO.
Material e métodos
O vinagre de maçã da marca Castelo foi fortificado com 12,5 µg/mL AU e 12,5 µg/mL AO a partir de soluções metanólicas. Um cartucho C8 de EFS (500 mg, 3 mL, Spe-ed - Applied Separation) foi ativado com 5 mL de metanol (MeOH) e condicionado com 5 mL de ácido acético pH 2,77. O cartucho foi carregado com 30 mL de vinagre de maçã fortificado e lavado com 10 mL de 30:70 MeOH/HCOOH 0,05%. As eluições foram realizadas com volumes de 3 mL de MeOH/HCOOH 0,05% nas proporções de 60:40, 70:30, 80:20 e 90:10 e finalmente com MeOH. Em um segundo experimento, dois cartuchos foram identicamente ativados, condicionados e carregados, sendo testadas diferentes composições de lavagem (60:40 e 65:35 MeOH/HCOOH 0,05%) seguidas por eluição com 5 mL de 90:10 MeOH/HCOOH 0,05% e de metanol. Os teores de AU e AO foram determinados através de CLAE (SIANI et al, 2013) contra padrões em metanol em coluna SymmetryShield RP18 250×4,6 mm, 5 μm, pré-coluna Supelguard LC-18 2 cm, a 30ºC e fase móvel acetonitrila/H3PO4 1,25% 98:2 na vazão de 0,6 mL/min. Detecção a 206 nm e 20 μL de injeção.
Resultado e discussão
A composição de eluente foi planejada para facilitar a remoção subsequente dos
solventes voláteis e obter boa resolução na separação, uma vez que o ácido
fórmico mantém os analitos na forma não ionizada. As composições de lavagem e
inicial de eluição foram planejadas a partir do conhecimento da força de
solvente para elevada retenção dos analitos em modo reverso (SANTOS et
al, 2013). As recuperações de AU e AO em cada fração eluída (Tabela 1)
indicam a saturação em 375 µg no cartucho no final da carga. A maior perda de
AO, relativamente ao AU, pode estar relacionada à sua menor capacidade de
retenção em CLAE modo reverso (SIANI et al, 2013 e Figura 1). Com a
eluição 60:40 MeOH/HCOOH 0,05% houve intensa dessorção de pigmentos, mas os
ácidos não eluíram. A retirada deste material é importante, mas para eluentes
com maior teor de metanol houve perda dos ácidos, em 5% AU e 2% AO. Esta perda
também foi alcançada com 65:35 MeOH/HCOOH 0,05% no segundo experimento. Assim,
para a etapa de lavagem recomenda-se 5 mL 60:40 MeOH/HCOOH 0,05%. A seletividade
da extração em 90:10 MeOH/HCOOH 0,05% é evidenciada na recuperação dos ácidos (>
80%, Tabela 1). No segundo experimento, com o maior volume dos eluentes (5 mL ao
lugar de 3 mL), a lavagem de 60:40 MeOH/HCOOH 0,05% e a eluição de 90:10
MeOH/HCOOH 0,05%, AU e AO eluíram completamente nesta última composição, não
havendo dispersão para eluição subsequente (com MeOH). Este resultado demonstrou
a eficácia destas composições e volumes na extração seletiva de AU e AO. Os
cromatogramas resultantes da eluição de 90:10 MeOH/HCOOH 0,05% (Figura 1)
indicam a especificidade do processo, uma vez que revelam claramente, na faixa
de retenção dos analitos de interesse, a diminuição de interferentes originários
da matriz.
Conclusões
A EFS-C8 demonstrou ser um método conveniente de preparação de amostra para quantificação de AU e AO em produtos comerciais que envolvam processamento do fruto com casca, como o vinagre de maçã, uma vez que melhora a sensibilidade da análise. Alta especificidade e alta recuperação de AU e AO foram alcançadas com eluentes de MeOH/HCOOH 0,05%, sendo as composições com razão volumétrica 60:40 e 90:10 recomendadas para a lavagem do cartucho e eluição dos analitos, respectivamente.
Agradecimentos
CNPq, FAPERJ, RPT-PDTIS/FIOCRUZ.
Referências
JANICSÁK, G.; VERES, K.; KÁLLAI, M.; MÁTHÉ, I. Gas Chromatographic Method for Routine Determination of Oleanolic and Ursolic Acids in Medicinal Plants. Chromatographia, v. 58, 295-299, 2003.
SANTOS, D. S.; MAZZEI, J.L.; SIANI, A.C. Aplicação de Fase Estacionária C18 no Isolamento Cromatográfico de Ácidos Triterpênicos Pentacíclicos. XIV Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - Regional Rio de Janeiro, Niterói, 2013.
SIANI, A. C.; NAKAMURA, M. J.; SANTOS, D. S.; MAZZEI, J. L.; NASCIMENTO, A. C. E; VALENTE, L. M. M. Efficiency and Selectivity of Triterpene Acid Extraction from Decoctions and Tinctures Prepared from Apple Peels. Pharmacognosy Magazine, v. 10, 225-231, 2013.
STENHOLM, Å.; GÖRANSSON, U.; BOHLIN, L. Bioassay-Guided Supercritical Fluid Extraction of Cyclooxygenase-2 Inhibiting Substances in Plantago major L. Phytochemical Analysis, v. 24, 176-183, 2013.
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