Screening microbiológico de colônias de fugose das sementes de andiroba (Carapa guianensis) e das raízes de mandioca (Manihot suculenta) que produzam atividades b-glicosidásicas

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Iniciação Científica

Autores

Passos, L.C. (UFPA) ; Lee, M.S.O. (UFPA) ; Souza, M.G.S. (UFPA) ; Santos, A.S. (UFPA)

Resumo

As enzimas hidrolíticas produzidas por fungos filamentosos possuem amplo interesse biotecnológico atualmente seja na biorremediação de rejeitos industriais, na fabricação de anticancerígenos, anticoagulantes e outros. O objetivo do trabalho foi selecionar linhagens de andiroba(Carapa guianensis) e mandioca (Manihot suculenta)que produzisse a β-glicosidase, enzima que ao hidrolisar isoflavonas possui ação anticancerígena e anticoagulante. Foram selecionadas linhagens, inoculadas e realizado cultivo submerso por 10 dias. A partir das amostras coletadas, foram realizadas as análises da atividade β- glicosidase e quantificação de glicose e proteína. Os fungos selecionados apresentaram bons resultados, com atividade enzimática de 0,1914U/mL e 0,2128U/mL, mostrando grande potencial de produção.

Palavras chaves

atividade b-glicosidásica; fungos filamentosos; biotecnologia

Introdução

Os microrganismos, principalmente os fungos filamentosos, podem produzir como metabólitos secundários as enzimas, estas que possuem ação catalisadora em meio a substratos e despertam cada dia mais interesse tecnológico justamente por ter a capacidade de substituir processos químicos tradicionais por processos biotecnológicos eficientes. Esses fungos possuem numerosos genes de enzimas hidrolíticas que se desenvolvem bem em resposta ao pH, temperatura e aos nutrientes disponíveis em condições ótimas quando são fornecidos no meio extracelular. Essas enzimas fúngicas, uma vez secretadas, hidrolisam fontes de carbono de alto peso molecular, liberando unidades menores que podem ser absorvidas e oxidadas para a obtenção de energia. Devido à eficiência desses mecanismos de secreção protéica pela diversidade de enzimas que produzem para a hidrólise de substratos naturais, os fungos filamentosos constituem uma fonte importante na busca de novos produtos de interesse industrial e de inovação biotecnológica. A enzima β-glicosidase possui a função de hidrolisar as isoflavonas que normalmente estão glicosiladas e que geralmente desenvolvem as angliconas que possuem ação anticancerígena e anticoagulante. Esta enzima representa um grupo de enzimas com funções variadas e fazem parte da família das glicosil hidrolases 1 . Esta classe de glicosilase catalisa normalmente a hidrolise de ligações glicosídicas β-1,4, β-1,3 e β-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril β-D-glicosídeos. O objetivo do estudo foi selecionar linhagens de fungos das sementes de andiroba(Carapa guianensis) e raízes de mandioca(Manihot suculenta) que produzam atividades β-glicosidásicas.

Material e métodos

Foram selecionadas 10 linhagens de fungos filamentosos isolados das sementes de andiroba e das raízes de mandioca (linhagens que estão preservadas na micoteca do LabISisBio-UFPA) para a avaliação da atividade β-glicosidase. As linhagens foram inoculadas em placa de petri com meio de cultura FPY(1% de farelo, 0,25% de peptona e extrato de levedura e 1,5% de agar) onde os mesmos cresceram 10 á 15 dias. Em seguida foi realizado o cultivo submerso em erlenmayer de 250mL contendo 130mL de meio de cultura (1% farelo e sais inorganicos) em pH=6,0. Esse cultivo foi feito por 10 dias consecutivos em shaker rotacional a 30°C e 120rpm e a cada dia era tirada uma alíquota do caldo enzimático para as posteriores análises de atividade enzimática, glicose e proteína das amostras. Para a quantificação da atividade β-glicosidase foi adicionado ao tubo de vidro de 10mL um volume de 800μl da solução de 1mM de PNPG diluído em tampão citrato fosfato 0,1M pH 5 e foi incubado em uma estufa a 30ºC por 5 minutos. Ao mesmo foi adicionado 250μl da amostra e incubou-se novamente a 30ºC. A reação foi parada pela adição de 1000μl de carbonato de sódio 0,25M pH=9,0. As leituras foram realizadas a 420nm com espectrofotômetro UV-Vis. Para a análise de glicose as amostras foram centrifugadas a 300rpm por 5 minutos e transferidas 100μL para tubos de ensaio. Adicionou-se em cada 200μL de água desionizada e 300μL de reagente DNS. Todos os tubos foram colocados em banho Maria com água a 100ºC durante 5 minutos. Esfriou-se em água corrente e adicionou-se 100μL de água desionizada em cada. Fez-se a leitura das amostras em 540nm. Para a análise de proteína retirou-se 200µL da amostra e adicionou-se 1800µL de uma solução de Bradford em tubo de ensaio. Esperou-se 5 minutos de tempo reacional e leu-se em 595nm.

Resultado e discussão

Para a quantificação das atividades enzimáticas, glicose e proteína de cada fungo foi necessário construir uma curva de quantificação para cada análise a fim de obter as concentrações de cada amostra a partir da equação da reta. Na equação da reta é possível relacionar a absorvância e obter os valores das concentrações nas análises. Na atividade enzimática há a relação de uma equação para calcular a mesma em U/mL como é observado nos gráficos. Nos gráficos construídos é possível observar o comportamento da atividade β- glicosidásica durante os 10 dias de cultivo. É importante ressaltar que todas as análises foram feitas em duplicata e também foram feitos o branco referente ao reagente e o branco referente a enzima para saber se haviam interferentes e/ou produção de metabólitos durante os dias. A partir dos dados obtidos, observou-se que o fungo MIBA 0500 para a enzima β- glicosidase durante um período de 240 horas produziu até aproximadamente 0,31mg/mL de glicose no meio até o final do cultivo. A maior produção de atividade β-glicosidásica foi de aproximadamente 0,2128U/mL após 192 horas de incubação e a maior produção de proteína foi também após 192 horas obtendo um valor igual a 75,78mg/mL. O fungo MEϕ-P7A também se destacou por produzir até aproximadamente 0,72mg/mL de glicose no meio até o final do cultivo. A maior produção de atividade β-glicosidásica foi de aproximadamente 0,1914U/mL após 192 horas de incubação e a maior produção de proteína foi após 240 horas, último dia, obtendo um valor igual a 123,06 mg/mL. Segundo a literatura, esses valores assemelham-se aos encontrados, onde o aumento dessas atividades irão se diferenciar pelas condições boas e/ou ótimas que estão sendo oferecidas, como pH, temperatura, agitação e concentração do substrato.

A figura 1 remete ao cultivo submerso para o fungo MIBA 0500 analisando-se a atividade enzimática e proteica durante um período de 240 horas.


A figura 2 remete ao cultivo submerso realizado para o fungo P7A onde avalia-se o comportamento da atividade enzimática e proteica durante 240 horas.

Conclusões

A partir dos resultados obtidos conclui-se que nas análises da enzima β- glicosidase os fungos apresentaram maior potencial de produção em aproximadamente 192 horas. Os fungos MEϕ-P7A e MIBA 0500 foram os que apresentaram maior potencial de produção da enzima e nas análises de proteínas totais observou-se que os melhores fungos foram MEϕ-C7A e MEϕ- C8. É importante ressaltar que o fungo MIBA 0500 foi o único que apresentou um crescimento proporcional e que ainda serão feitas análises com eletroforese.

Agradecimentos

Agradeço ao LabISisBio-UFPA pela ajuda no desenvolvimento do projeto, ao Pibic/UFPA e ao CNPq pela bolsa concedida.

Referências

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