LECTINAS DE Croton campestris: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE INSETICIDA CONTRA Aedes aegypti.

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Iniciação Científica

Autores

Silva, D. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Melo, A.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; da Silva, C.D. (UFPE) ; Costa, J.A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Navarro, D.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Paiva Guedes, P.M. (UFPE) ; áraújo Sá, R. (UFPE)

Resumo

Croton campestris (CC) é uma planta utilizada na medicina popular para o tratamento de artrose e sífilis. Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos, propriedade relacionada ao seu papel de defesa contra insetos. O trabalho teve como objetivo caracterizar a lectina de CC e avaliar a atividade larvicida do extrato salino (ES) sobre o estágio larval L4 de A. aegypti. O ES foi realizado com 24g da farinha das folhas em 480 ml de NaCl 0,15M. ES apresentou uma atividade hemaglutinante específica de 7,728UH/mL. PF2, resultante da precipitação com NH4(SO2), apresentou uma melhor AHE e foi a escolhida para a purificação da lectina em cromatografia de quitina. Para detectar a homogeneidade da lectina (PII) foi utilizada a eletroforese. O Bioensaio apresentou CL50 entre 12 e 13ppm

Palavras chaves

Lectinas; Aedes aegypti; Croton

Introdução

O gênero Croton detém expressiva relevância econômica, alicerçada em seu conteúdo de óleos essenciais e diversas substâncias ativas como flavonoides e alcaloides. As espécies desse gênero são empregadas na medicina popular demonstrando algumas propriedades terapêuticas comprovadas. Os estudos existentes centrados em espécies de Croton são ainda escassos e dizem respeito às áreas de fitoquímica e farmacologia. Croton campestres, “velame do campo, é uma planta utilizada na medicina popular. Seu uso é feito através do chá da folhas, sendo indicados para o tratamento de artritismo e artrose (ABREU et al., 2001). Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos, propriedade que está relacionada ao seu papel como proteínas de reserva, de defesa contra microrganismos fitopatogênicos e insetos (SILVA et al., 2008). A dengue é uma infecção viral causada pelo arbovírus do gênero Flavivirus (família Flaviviridae), que possui quatro diferentes sorotipos: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. A dengue é também um dos principais problemas de saúde pública no mundo e uma das doenças de maior incidência no Brasil. Atualmente os casos de dengue vêm preocupando as autoridades sanitárias em virtude do grande potencial desta doença em assumir formas graves e letais. O vírus da dengue é transmitido através da picada de mosquitos do sexo feminino infectado. Sabe-se que o principal componente do trato digestivo dos insetos são carboidratos, sendo assim as lectinas tornam-se uma forte ferramenta para o controle destas infestações nas zonas urbanas (MACEDO et al., 2007). O trabalho teve como objetivo caracterizar a lectina de CC e avaliar a atividade larvicida do extrato salino (ES) sobre o estágio larval L4 de A. aegypti.

Material e métodos

10 g de farinha de folhas de C.C (10 g) foi submetida à extração a 10 % (p/v) em NaCl 0,15 M (100 mL), por 48 h em temperatura ambiente e em repouso, seguida de filtração em gaze e centrifugação por a 4 ºC. O extrato resultante foi denominado extrato salino (ES). A Atividade Hemaglutinante (AH) foi realizada segundo a metodologia descrita por Kennedy et al., (1995). O ES foi submetido ao fracionamento com NH4(SO4), visando à purificação parcial das proteínas presentes, de acordo com a técnica de Green & Hughes (1995). Obtendo-se a melhor fração proteica com uma saturação de 20-40% (PF2). A determinação da quantidade de proteínas foi realizada de acordo com Lowry et al. (1951). A coluna (7,5 cm x 1,5 cm) foi empacotada com 10 mL de quitina (polímero de N- acetilglicosamina) e o fluxo ajustado para 20 mL/h. A matriz foi equilibrada com NaCl 0,15M. Uma alíquota de 2,0 mL de PF2 foi aplicada à coluna, que foi lavada com NaCl 0,15 M até a obtenção de uma absorbância (280 nm) menor que 0,05. A eluição foi efetuada com ácido acético 1,0 M. As frações (2,0 mL) coletadas foram monitoradas por absorbância a 280 nm e AH. O pico proteico eluído contendo AH foi definido como a lectina (PII) de C.C. PII foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes e redutoras de acordo com Laemmli (1970). Para o bioensaio foi utilizado o ES segundo a metodologia proposta por Navarro et al. (2003) de acordo com as recomendações da Organização Mundial de Saúde. Para todas as concentrações da amostra, foi utilizado um volume final de 20 mL e 20 larvas em estágio L4. Todos os ensaios foram conduzidos com fotoperiodismo 12:12 e foram consideradas mortas quando não respondiam aos estímulos como determina a OMS.

Resultado e discussão

O material botânico foi coletado no município de Caruaru, Pernambuco. Folhas Croton campestris foram submetidas à secagem em estufa a 35ºC por 6 dias e triturados em multiprocessador até a obtenção de uma farinha (40 mesh). Foi observado que o melhor método de extração da lectina de Croton campestris é a partir do repouso, método também usado por Santana (2004) no isolamento de lectinas da Macrotyloma axillare. O extrato resultante apresentou uma melhor AHE de 7,728UH/mL. AH específica (AHE) foi determinada pela razão AH/concentração de proteínas (mg/mL). A AH está relacionada a especificidade e afinidades dos sítios de ligação das lectinas a carboidratos presentes nas paredes dos eritrócitos. A fração proteíca (PF2) foi inibida com N-acetilglicosamina, que estimulou a purificação da lectina através de cromatografia de afinidade em colunas de quitina. A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) realizada em condições desnaturantes e redutoras mostrou apenas uma subunidade proteica com peso molecular aparente de 14,4 KDa (Figura 1). Quanto aos ensaios larvicidas observou-se que todas as preparações do ES foram capazes de matar as larvas de A. aegypti. Observou-se que as diluições do extrato de 30,40 e 50 ppm (0,3, 0,4, 0,5 microgramas, respectivamente), apresentaram as melhores atividades. A ação tóxica de lectinas inseticidas tem sido relacionada à ligação dessas proteínas através de interações di-sulfetos e ligações de hidrogênio a glicoproteínas presentes no trato digestivo de insetos. Os testes indicaram que a LC50 está entre 12 e 13 ppm.

Eletroforese em condições desnsturantes e redutoras da Lectina de Croton Campestris apresentando uma subunidade proteica

Conclusões

PF2 foi inibida com N-acetilglicosamina (GlcNAc), que estimulou a purificação da lectina (PII) por cromatografia de afinidade em colunas de quitina. A banda eletroforética mostrou uma subunidade com peso aparente de 14,4 Kda. ES proteico induziu a mortalidade sobre as larvas utilizadas. Os testes indicaram que a LC50 está entre 12 e 13 ppm. A ação inseticida do ES sobre o Aedes aegypti, evidencia que sua propriedade inseticida pode ser explorada biotecnologicamente.

Agradecimentos

A FACEPE pelo apoio financeiro. Ao Laboratório de Ecologia Química – DQF. Ao Laboratório de Glicoproteínas da UFPE.

Referências

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