ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Egito, E.M.N. (UFPE) ; Oliveira, M.D.L. (UFPE) ; Andrade, C.A.S. (UFPE)
Resumo
Avaliamos a performance de um imunossensor construído pela adsorção física de anticorpo monoclonal Anti-LDL (anti-LDL) sobre filme híbrido auto-organizado de polivinil formal (PVF) e nanopartículas de ouro (NanoAu), em eletrodo de ouro e frente à amostras séricas humana. Utilizamos técnicas eletroquímicas, tais como voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) para avaliação da capacidade sensora do imunossensor. O imunossensor apresentou um limite de detecção inferior em 30 mg/dL com uma excelente sensibilidade e boa capacidade linear. Os resultados referentes às análises imunoturbidimétricas são compatíveis com os dados eletroquímicos e sugerem uma nova alternativa, mais rápida e sensível, para diagnóstico de hipercolesterolemia.
Palavras chaves
Imunossensor; Hipercolesterolemia; Aterosclerose
Introdução
A aterosclerose se refere a uma condição patológica em que a luz do vaso sanguíneo é bloqueada pela formação de uma placa de gordura, composta principalmente pelo acúmulo de colesterol. Podemos citar quatro principais tipos de colesteróis presentes na corrente sanguínea: Quilomícrons (QM), Lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), Lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e Lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL-C). O colesterol tornou-se um dos principais parâmetros que são mensurados em laboratórios de análises clínicas, representando um aumento na demanda por novas tecnologias de testes diagnósticos, nos últimos anos (Heron M, 2012; Marazuela et al., 1997). A lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), é a principal lipoproteína aterogênica e tem sido intensamente sugerida pelo Programa Nacional de Educação do Colesterol (NCEP), como o principal alvo da terapia de redução do colesterol (Ahmadrajia e Killard, 2013). A importância de reduzir o risco de doença arterial coronariana (DAC) por redução de colesterol LDL, já foi demonstrado por ensaios clínicos (Zhang et al., 2012; ATPIII, 2002; Eleni T, 2005). Em análises clínicas, o método mais amplamente utilizado para quantificação sérica de colesterol LDL, é o imunoturbidimétrico. Se trata de um método relativamente simples, que requer um tempo para análise relativamente alto (± 12 minutos). A adsorção de anticorpos monoclonais anti-LDL em diferentes substratos, tem sido largamente estudada no intuito do desenvolvimento de imunossensores “point of care”, com aplicação em análises clínicas (Ahmadrajia e Killard, 2013). Neste estudo, desenvolvemos um imunossensor eletroquímico e avaliamos sua sensibilidade frente às amostras séricas humanas obtidas de punção venosa.
Material e métodos
A análise eletroquímica foi realizada através de um Potencistato/Galvanostato Autolab 128N.As medidas voltamétricas (VC) e de espectroscopia de impedância eletroquímica(EIE)foram realizadas numa célula eletroquímica convencional de três eletrodos imersos em 20 mL de solução de ferro-ferricianeto de potássio, K4[Fe (CN)6] / K3[Fe(CN)6] (1:1), a 10 mM,atuando como sonda redox.O eletrodo de trabalho utilizado foi o eletrodo de ouro modificado,o eletrodo de referência foi o de Ag∕AgCl saturado com KCl e o contra-eletrodo foi o de platina. As análises de VC foram realizadas em diferentes etapas de construção do biossensor, a um potencial de varredura fixo de -0,2 a 0,7 V, a temperatura ambiente. Os espectros da EIE foram obtidos numa faixa de freqüência entre 100 mHz a 100 KHz com um potencial de amplitude alternada de 10 mV. O polivinil formal (PVF), foi obtido da Sigma Aldrich e preparado a 0,1%, utilizando o clorofórmio como solvente. A seguir 150 µL das nanoAu foram diluídas em clorofórmio (60%) e etanol (40%). Posteriormente, foi realizada uma mistura de 1mL de PVF (0,1%) com 150 µL da nanoAu. O sistema PVF_nanoAu foi adsorvido sobre a superfície do eletrodo de ouro por incubação por 10 minutos.Em seguida,foi adicionado 1uL do anticorpo anti-LDL sobre a superfície do eletrodo modificado com o sistema PVF_nanoAu por 10 minutos. Posteriormente,o sistema PVF_nanoAu_Anti-LDL,foi exposto a amostras de sangue periférico humano com diferentes concentrações do colesterol LDL(30, 70, 95, 115 e 135 mg/dL).A análise da performance do imunossensor foi comparada ao método padrão atualmente utilizado para quantificar colesterol LDL (Imunoturbidimetria).A quantificação sérica do LDL-C foi realizada em triplicata em sistema automatizado ADVIA 1800 (Siemens, USA).
Resultado e discussão
Interpolando os dados obtidos na imunoturbidimetria e na eletroquímica, pudemos
evidenciar uma função do tipo linear de maneira que, com o aumento da
concentração sérica do LDL-C, observado na imunoturbidimetria (mg/dL), pudemos
observar um aumento na Rct, observado na impedância eletroquímica. Através do
ajuste linear, foi obtido um r2 de 0,97123, ou seja, com 97% de correlação.
Podemos observar a sinergia e coerência entre os dados obtidos na VC e na EIE,
sendo observado um aumento gradativo da resistência de transferência de carga
(RCT) à medida que há o aumento de LDL-C nas amostras analisadas. Após a
interação do sistema PVF_nanoAu_antiLDL com os soros de LDL (30-135 mg/dL) foi
observado um bloqueio quase que total da resposta amperométrica do sistema na
concentração de 135 mg/dL, este processo indica que ocorreu biointeração entre
anticorpo anti-LDL-antígeno. O ajuste linear obtido dos dados potenciometricos,
evidencia uma correlação acima de 97% entre os dados obtidos. Portanto, nossa
metodologia apresenta uma intrínseca correlação com o método mais amplamente
utilizado para dosagens de LDL-C. Salientando que o imunossensor aqui
apresentado, necessita de aproximadamente 2 minutos para a obtenção dos
resultados, enquanto que o sistema imunoturbidimétrico necessita de, não menos
que, 12 minutos para a obtenção de resultados. Nossa metodologia apresenta
resultados fidedignos, em comparação com a metodologia atual, com a vantagem de
ser 6 vezes mais rápida, diminuindo o tempo de diagnóstico e aumentando a
sobrevida do paciente. Desta forma, podemos apresentar a possibilidade de
detecção eletroquímica de LDL baseado em matriz de polivinilformal e
nanopartículas de ouro para análise de níveis sanguíneos em pacientes com
hipercolesterolemia.
Conclusões
Desenvolvemos um imunossensor formado a partir da adsorção física de filme híbrido composto por polivinil formal e nanopartículas de ouro com posterior imobilização de anticorpo monoclonal Anti-LDL.O imunossensor demonstrou uma excelente performance entre o range de concentrações avaliadas (30 mg/dL – 135 mg/dL), em comparação com o método padrão para análise (imunoturbidimétrico).Dentre as diversas vantagens apresentadas pelo imunossensor, podemos citar a rápida obtenção de resultados (aproximadamente 6 vezes mais rápido), em comparação ao método imunoturbidimétrico.
Agradecimentos
FACEPE, Rede Nanobiotecnologia-CAPES, CNPq e Laboratórios de Análises Clínicas Gilson Cidrim LTDA.
Referências
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